[發明專利]一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法

無效

• 申請號: 201210368104.9
• 申請日: 2012-09-27
• 公開（公告）號: CN102888458A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 易弋;楊軍;黃稀;黎婭;伍時華;羅福廣;左躍
• 申請（專利權）人: 廣西工學院;柳州市魚家樂飼料有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14
• 代理公司: 柳州市榮久專利商標事務所(普通合伙) 45113
• 代理人: 周小芹

技術領域

本發明涉及一種無乳鏈球菌的檢測方法，特別是一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法。

背景技術

羅非魚是全球主要經濟魚類之一，具有生長快、抗病力與抗逆性強、肉質好、繁殖力強、適應性廣以及群體產量高等一系列優點，現已成為南方各省出口型養殖規模最大的魚類，產量占全世界的50％，羅非魚產業對于增加就業機會、提高農民收入都有十分重要的意義。然而近年來，由于高密度飼養，種群退化，加上養殖水質、環境及氣候惡化，各類病害時常大面積爆發，嚴重影響到羅非魚產業的健康發展。2009?~2011年，國內主要的羅非魚養殖區爆發了非常嚴重的羅非魚流行病，患病羅非魚在水面離群獨游，游姿失衡，眼球突出，被養殖戶形象的稱為“突眼病”。該病發病率一般達20％～30％，死亡率在95％以上。病原分析表明引起羅非魚“突眼病”的病原為鏈球菌，主要為海豚鏈球菌(Streptococcus?iniae)和無乳鏈球菌(Streptococcus?agalactiae)。據統計，近幾年因鏈球菌病導致羅非魚產業的損失達20億元，如何防治羅非魚鏈球菌病已成為農業和漁業管理部門最為關注的問題。

分子診斷技術是當代醫學發展的重要前沿領域之一，主要包括免疫診斷技術和分子生物學診斷技術，二者都具有操作簡便、快速、準確、特異性強、陽性率高的特點。免疫學技術是利用特異性抗原抗體反應，檢測病原微生物，簡化了病原微生物的鑒定步驟，備受關注。各大文獻數據庫提供的數據顯示，幾乎建立了所有病原體的血清學檢測方法，表明該方法已成為一種微生物實驗室常用的成熟的檢測技術，具有操作簡便、快速、準確、特異性強、陽性率高等特點。免疫學方法中常見的幾種診斷技術包括凝集技術、熒光抗體技術、酶聯免疫技術等。隨著分子生物學技術的迅速發展，使人們對微生物的認識從外部表型逐漸轉向內部基因結構特征，微生物的檢測也從生化、免疫方法轉向基因水平檢測，對于那些難培養和不可能培養的微生物，可直接通過獲得基因信息，給微生物學的檢測帶來嶄新的領域。分子生物學診斷技術中常用的方法有PCR技術、核酸分子雜交、多位點序列分型、環介導等溫擴增技術等。同免疫診斷試劑相比較，分子生物學診斷試劑具有生產工藝簡單，靈敏度更高的特點，逐漸成為新一代分子診斷試劑開發的主流。

CAMP因子是無乳鏈球菌特異性產生的一種蛋白質，是無乳鏈球菌區別于其他細菌的重要特征指標。在傳統的無乳鏈球菌生理生化鑒定中，CAMP試驗已成為鑒定無乳鏈球菌的關鍵試驗。CAMP因子的編碼基因是cfb基因，利用分子生物學技術檢測樣品中是否含有cfb基因即可判斷樣品是否受到了無乳鏈球菌的感染。

環介導等溫擴增法(?loop-mediated?isothermal?amplification，簡稱LAMP)是2000?年開發的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6?個區域設計4?種特異引物，利用一種鏈置換DNA?聚合酶在等溫條件(63?℃左右)?保溫30~60?min，即可完成核酸擴增反應。與常規PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等過程。LAMP?是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優于PCR技術，能不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測。

羅非魚鏈球菌病是危害羅非魚養殖業最嚴重的爆發性疾病，無乳鏈球菌是最主要的病原菌。通過分子檢測手段，在養殖過程中定期檢測羅非魚是否受到無乳鏈球菌的感染，是預防鏈球菌病的一種有效措施。目前已公開的專利和論文多使用PCR的方法檢測無乳鏈球菌，該方法能夠特異性的檢測無乳鏈球菌，但檢出靈敏度低，只適用于感染后期魚體內病原菌含量較多的時候。由于感染已發展至后期，因此在得出檢測結果后采取預防措施的效果會大打折扣，更有可能在采取措施之前，疾病就已爆發。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提供一種測試靈敏度高、測試速度快的羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法。

解決上述技術問題的技術方案是：一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，包括以下步驟：

S1.抽取待檢羅非魚的血液1~2?mL，提取血液中的總RNA；

S2.以所提取的總RNA為模板，進行反轉錄反應，獲得待測羅非魚血液樣品的cDNA；

S3.根據無乳鏈球菌的cfb基因序列設計并合成用于環介導等溫擴增的引物；