[發明專利]一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法

無效

• 申請號: 201210368104.9
• 申請日: 2012-09-27
• 公開（公告）號: CN102888458A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 易弋;楊軍;黃稀;黎婭;伍時華;羅福廣;左躍
• 申請（專利權）人: 廣西工學院;柳州市魚家樂飼料有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14
• 代理公司: 柳州市榮久專利商標事務所(普通合伙) 45113
• 代理人: 周小芹

1.一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1.抽取待檢羅非魚的血液1~2?mL，提取血液中的總RNA；

S2.以所提取的總RNA為模板，進行反轉錄反應，獲得待測羅非魚血液樣品的cDNA；

S3.根據無乳鏈球菌的cfb基因序列設計并合成用于環介導等溫擴增的引物；

S4.以上述步驟S2中獲得的cDNA為模板，利用上述步驟S3中合成的引物，進行目標基因的環介導等溫擴增；

S5.擴增完成后，檢測反應結果，結果陽性的表示供檢羅非魚感染了無乳鏈球菌，結果陰性的表示供檢羅非魚沒有感染無乳鏈球菌。

2.根據權利要求1所述的一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，其特征在于：步驟S1中所述的提取羅非魚血液總RNA，具體方法如下：

S11.抽取待檢羅非魚的血液1?mL，將其于轉速為5000?rpm離心10?min，去掉上清液后加入1?mL用于總RNA抽提的trizol試劑，反復吹打重懸沉淀，得重懸液；

S12.將上述步驟S11中所得的重懸液于室溫靜置5min后，每1?mL?trizol加0.2?mL氯仿，用手輕搖3-5次，使得氯仿和trizol試劑混合均勻，在室溫靜置2-3min后，于4-8℃，轉速12000?rpm離心15?min，離心后，溶液分為水層、中間層和氯仿層共3層；

S13.將上述步驟S12中的水層0.4-0.5?mL轉移到一只干凈的1.5?mL離心管中，加入等體積的異丙醇，用手輕搖3-5次混勻，在室溫放置10?min，于4-8℃，轉速12000?rpm離心10?min，離心后棄去上清液，所得沉淀備用；

S14.將上述步驟S13中所獲的沉淀，用1mL濃度為75%乙醇洗滌后，在4-8℃，轉速7500?rpm離心5?min，離心后棄去上清液，所得沉淀即為提取的總RNA；

S15.將上述步驟S14獲得的RNA自然干燥后加入40?μL去RNA酶水進行溶解。

3.根據權利要求1所述的一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，其特征在于：步驟S2中所述的以所提取的總RNA為模板，進行反轉錄反應，具體方法如下：

S21.配制反應體系20μL，包括RNA模板1μl，5倍反應緩沖液4μL，濃度為10?mmol/L的dNTP?2μL，濃度為10U/μL?的RNA酶抑制劑2μL，濃度為25μmol/L的隨機引物1μL，濃度為5U/μL的反轉錄酶2μL，添加去RNA酶水至總體積20μL；

上述的5倍反應緩沖液由pH=8.3的Tris-HCl?250?mmol/L，KCl?375?mmol/L，MgCl₂?40?mmol/L和DTT?50?mmol/L組成而得；?

S22.輕微混勻通過上述步驟S21所得的反應液，于室溫放置10?min后移入?42℃恒溫槽中保溫1?h；

S23.將經過上述步驟S22的反應液于冰水中冷卻2min完成反轉錄反應，獲得待測羅非魚血液樣品的cDNA。

4.根據權利要求1所述的一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，其特征在于：步驟S3中所述的引物是根據GenBank數據庫提供的無乳鏈球菌的cfb基因序列，并結合環介導等溫擴增技術的原理設計并合成，分別是：

P1:?5-ATGAACGTTACACATATGATGT-3；

P2:?5-GTTCCCTGAACATTATCTTTGA-3；

P3:?5-TCAGCATGTACTTCTAATACAGCTGATCTATCTGGAACTCTAGTGG-3；

P4:?5-AGTGACAACTCCACAAGTGGTAGCTATCTTGATCAAGCTTTTGAG-3。