[發明專利]特異促進肝細胞CYP3A4基因高表達的慢病毒表達載體及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201210366793.X
• 申請日: 2012-09-28
• 公開（公告）號: CN102864171A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 徐新云;毛侃瑯;何曉陽;毛吉炎;應明
• 申請（專利權）人: 深圳市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;A61K48/00
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所(普通合伙) 44248
• 代理人: 胡吉科

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及特異促進肝細胞CYP3A4基因高表達的慢病毒表達載體及其構建方法與應用。

背景技術

細胞色素P450酶(Cytochrome?P450,?CYP450)是一類重要的混合功能氧化酶系統，主要分布在生物體的內質網上和線粒體中，參與許多內源性和外源性物質的生物轉化過程。CYP3A4屬于CYP450家族中的CYP3A亞族，由CYP3A4基因編碼，主要存在于肝臟中，約占肝臟CYP酶總量的30-40%，是肝臟中含量最豐富的CYP，也是最重要的人類藥物代謝酶。CYP3A4參與代謝大約38類多于150種的臨床治療藥物，包括抗生素、抗真菌藥物、安定藥物、抗組胺劑、抗抑郁藥物、激素以及鈣拮抗劑等等，此外，CYP3A4還參與一些前體致癌物的激活過程。因為其廣泛的代謝底物譜，許多藥物不良反應是由藥物相互作用導致CYP3A4的代謝活性改變所引起的。

現有技術中，阮昊和徐田雪分別將CYP3A4基因cDNA片段連接到了pFastBac載體上，并將其包裝成桿狀病毒后感染sf9細胞，得到了能表達CYP3A4基因的sf9細胞，該細胞能夠用于體外研究藥物代謝，但因不是人源細胞不適用于外源物質對人毒理的相關研究；李敏將CYP3A4基因cDNA片段連接到了pYES2/CT-PCR載體上并將其導入到釀酒酵母BJ5628中實現CYP3A4的穩定表達，但因非人源細胞也不適用于外源物質對人毒理的相關研究?，F有技術中尚無可在人源細胞中持續、穩定且高效表達CYP3A4基因的載體。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，發明人在載體的選擇、重組構建方法等方面進行了大量的探索研究，預料不到地發現，將包含Xho?I酶切位點和Xma?I酶切位點的CYP3A4基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1表達載體的多克隆位點中可成功構建特異促進肝細胞CYP3A4基因高表達的慢病毒表達載體，從而完成本發明。

本發明提供一種特異促進肝細胞CYP3A4基因高表達的慢病毒表達載體，包括pLVX-AcGFP-C1表達載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列和CYP3A4基因cDNA序列；所述多克隆位點包括Xho?I酶切位點和Xma?I酶切位點，所述CYP3A4基因cDNA序列包括Xho?I酶切位點、CYP3A4基因編碼序列和Xma?I酶切位點，所述CYP3A4基因cDNA序列正向插入所述多克隆位點序列中。

采用上述技術方案，本發明提供的CYP3A4基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1表達載體構建得到的慢病毒表達載體具有轉染效率高，用量少，可持續、高效、穩定地提高CYP3A4基因表達的優點，可作為有力工具應用于制備治療CYP3A4基因表達異常相關疾病藥物的研究和開發中。

作為本發明的進一步改進，所述CYP3A4基因編碼序列通過PCR擴增獲得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列為：5’-CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT-3’，即SEQ?ID?NO：1，所述下游引物的序列為：5’-ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGCCATCC-3’，即SEQ?ID?NO：2。采用上述PCR引物序列，通過PCR可以擴增出CYP3A4基因編碼序列，并可成功插入至pLVX-AcGFP1-C1表達載體中持續表達CYP3A4基因，減少了序列合成費用，成本較低。

相應的，本發明還提供特異促進肝細胞CYP3A4基因高表達的慢病毒表達載體的構建方法，包括如下步驟：

A）?CYP3A4基因引物設計：根據CYP3A4基因編碼序列，使用Oligo?7分析后選取5’-CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT-3’，即SEQ?ID?NO：1作為上游引物，選取5’-ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGCCATCC?-3’，即SEQ?ID?NO：2作為下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物；所述上游引物和所述下游引物無引物二聚體，且退火溫度差距較小；