[發明專利]特異促進肝細胞CYP3A4基因高表達的慢病毒表達載體及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201210366793.X
• 申請日: 2012-09-28
• 公開（公告）號: CN102864171A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 徐新云;毛侃瑯;何曉陽;毛吉炎;應明
• 申請（專利權）人: 深圳市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;A61K48/00
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所(普通合伙) 44248
• 代理人: 胡吉科

1.一種特異促進肝細胞CYP3A4基因高表達的慢病毒表達載體，其特征在于：包括pLVX-AcGFP-C1表達載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列和CYP3A4基因cDNA序列；所述多克隆位點包括Xho?I酶切位點和Xma?I酶切位點，所述CYP3A4基因cDNA序列包括Xho?I酶切位點、CYP3A4基因編碼序列和Xma?I酶切位點，所述CYP3A4基因cDNA序列正向插入所述多克隆位點序列中。

2.根據權利要求1所述的特異促進肝細胞CYP3A4基因高表達的慢病毒表達載體，其特征在于：所述CYP3A4基因編碼序列通過PCR擴增獲得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列為：5’-CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT-3’，即SEQ?ID?NO：1，所述下游引物的序列為：5’-ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGC

CATCC-3’，即SEQ?ID?NO：2。

3.根據權利要求?2所述的特異促進肝細胞CYP3A4基因高表達的慢病毒表達載體的構建方法，其特征在于：包括如下步驟：

A）CYP3A4基因引物設計：根據CYP3A4基因編碼序列，使用Oligo?7分析后選取5’-CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT?-3’，即SEQ?ID?NO：1作為上游引物，選取5’-ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGCCATCC?-3’，即SEQ?ID?NO：2作為下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物；?

B）CYP3A4基因cDNA序列的獲得：用所述上游引物和所述下游引物進行PCR擴增，獲得大量CYP3A4基因編碼序列，然后將該序列進行加A尾反應后，用T4?DNA連接酶連接到pGM-T載體上得到連接產物，將該連接產物轉化到感受態大腸桿菌DH5α中，均勻涂布到含氨芐青霉素LB培養基平板上，挑取陽性單克隆菌落培養保存菌液并進行PCR初步鑒定，將初步鑒定結果說明CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液進行測序鑒定；用液體LB培養基培養測序鑒定正確的大腸桿菌，并抽提其中帶CYP3A4基因cDNA序列的pGM-T載體，用限制性內切酶XhoⅠ酶切回收后再用XmaⅠ酶切，電泳、切膠回收1526?bp大小的片段，此片段即為CYP3A4基因cDNA序列；

C）特異促進肝細胞CYP3A4基因高表達的慢病毒載體的構建和鑒定：提取質粒pLVX-AcGFP1-C1，用限制性內切酶XhoⅠ酶切回收后再用XmaⅠ酶切，電泳、切膠回收載體，再用T4?DNA?ligase將所述CYP3A4基因cDNA序列連接到pLVX-AcGFP1-C1表達載體中，得到連接產物，將該連接產物轉化到感受態大腸桿菌DH5α中，均勻涂布到含氨芐青霉素LB培養基平板上，挑取陽性單克隆菌落培養保存菌液并進行PCR初步鑒定，將初步鑒定結果說明CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液進行測序鑒定；

D）特異促進肝細胞CYP3A4基因高表達的慢病毒載體的抽提：將測序結果證實CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液擴增培養，對重組質粒進行抽提，得到特異促進肝細胞CYP3A4基因高表達的慢病毒表達載體。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的特異促進肝細胞CYP3A4基因高表達的慢病毒表達載體在制備治療CYP3A4基因表達異常相關疾病的藥物中的用途。