[發明專利]苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡及其制備方法

無效

• 申請號: 201210366789.3
• 申請日: 2012-09-27
• 公開（公告）號: CN102901819A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 杜道林;洪霞;張禎;薛永來
• 申請（專利權）人: 江蘇維賽科技生物發展有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

???本發明涉及β-腎上腺素受體激動劑檢測技術領域，特別是涉及苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡及其制備方法。?

背景技術

近年來，接連不斷的瘦肉精事件已成為中國食品安全領域揮之不去的幽靈。去年，湖南省成功破獲一起涉及福建、湖南、浙江三省的瘦肉精生產、銷售案件，并從飼料中檢測出以前從未出現過的苯乙醇胺A，這種瘦肉精新品種的出現，再次敲響了我國食品安全警鐘。?

苯乙醇胺A，又稱“克倫巴胺”，可被非法添加于豬和牛的飼料中，有刺激動物生長，加強蛋白質在動物體內沉積，提高基礎代謝水平，使體脂趨于分解等作用，也可促進豬生長速度加快、使其皮紅毛亮、瘦肉率提高。人食用含這種瘦肉精的肉后，會出現惡心、頭暈、四肢無力、手顫等中毒癥狀，甚至誘發高血壓、心臟病等。因此，近期被農業部第1519號公告列為“禁止在飼料和動物飲水中使用的物質”。?

現有技術對于苯乙醇胺A的檢測主要是高效液相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜法等檢測方法，但這些技術的缺陷明顯：設備昂貴、操作復雜、難以推廣。所以，建立一種簡單、有效、適合基層使用的測定方法是極其必要的。本發明的目的是研制一種更適合企業進行現場檢測且快捷簡便、成本低廉的定性檢測方法。?

發明內容

針對以上情況，本發明的目的就是為了克服現有技術存在的缺陷而提供一種苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，可有效解決能快速、簡便地檢測出β-腎上腺素受體激動劑苯乙醇胺A的問題。?

本發明的苯乙醇胺A膠體金檢測卡，包括包被了單克隆抗體膠體金標記物的膠體金結合墊、包被了苯乙醇胺A-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC膠板和塑料模具組成，在PVC膠板的一端依次粘附樣品墊、結合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。?

本發明的苯乙醇胺A膠體金檢測卡的制備方法，是由以下步驟實現：?

(1)膠體金溶液制備：取1?L?三角燒瓶1個，加入超純水495?mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl₄·3H₂O)?5?mL，配制成500?mL?0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)溶液5-7?mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5?min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8℃保存備用；

(2)抗體的預處理：將要標記的苯乙醇胺A抗體在1000?r/min,?4℃條件下，離心20?min，取上清，用0.01?mol/L?PBS稀釋成1?mg/mL；或者用0.01?mol/L?PBS稀釋成1?mg/mL，過0.22?μm濾膜；

(3)膠體金標記物的制備：取步驟(1)中的膠體金溶液40?mL，用0.25?mol/L?K₂CO₃調節膠體金溶液pH至?8.5，電磁攪拌器250?r/min攪拌，逐滴加入4?mL?含0.3?mg?抗體蛋白的蛋白溶液，反應10?min；逐滴加入4?mL?10%?BSA，繼續攪拌反應10?min；金標抗體溶液常溫低速（1500?r/min）離心10?min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4℃，12000?r/min?離心20?min，棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標抗體稀釋液定容至1?mL，制備成苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標記物；

(4)膠體金膜的制備：將步驟(3)苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5?μL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37℃烘干3?h，制成含苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜；

(5)包被膜制備：將羊抗鼠IgG抗體、苯乙醇胺A蛋白質偶聯物稀釋成1?mg/mL，用劃膜儀依次以1?μL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37℃包被2?h后，室溫自然晾干或者37℃烘干；

(6)樣品墊前處理：將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；

(7)檢測卡的組裝：PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。

所述步驟(5)中所包被的檢測線T設在質控線C的下方；?