[發明專利]小鼠肝臟羧酸酯酶基因克隆表達

無效

• 申請號: 201210366725.3
• 申請日: 2012-09-28
• 公開（公告）號: CN102925468A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 于源華;周帥;喬玉龍;王保學;張昊;姚健;王巖;王維;鄔磊
• 申請（專利權）人: 長春長理康源生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/70;C12N9/18
• 代理公司: 長春眾益專利商標事務所(普通合伙) 22211
• 代理人: 紀尚

1.一種小鼠肝臟羧酸酯酶基因克隆表達，其表達是：

（1）.以小鼠肝臟總RNA為模板，通過RT-PCR技術擴增了末端含有EcoR?I和Xho?I酶切位點的DNA片段，對其進行了亞克隆及測序，用軟件Vector?NTI對所測定序列與對應的NCBI序列進行比對分析，確定該基因為Mces1f；

EcoR?I?起始密碼子

GAATTCATGTTCCTTAGCACTCTGTTCCTGGTGTCTCTAGCAACCTGTGTGATTTGCGGAAATCCCTCTTCACCACCTGTGGTAGACACTGCTCATGGTAAAGTCCTGGGGAAACACGTGAACGTAGAAGGATTTTCACAGCCTGTGGCCGTCTTCCTGGGAATCCCCTTTGCCAAGCCCCCTCTTGGATCCCTGAGGTTTGCTCCACCACAGCCTGCAGAGCCCTGGAGCTCAGTGAAGAATGCCACCACCTACCCACCTATGTGCTCCCAAGATGCAGCTAGAGGACAGGCGGTCAATGACCTCATAACCAATAGAAAGGAGAAAATCCATCTTGAATTTTCTGAAGATTGCCTGTACCTAAATATTTACACTCCTGCGGACTTTTCAAAGAACAGTAGGCTACCGGTGATGGTGTGGATCCATGGAGGTGGACTGAAGCTGGGTGGGGCATCAAGCTTTGATGGACGGGCTCTCTCTGCATACGAAAATGTGGTGGTGGTGGCCATTCAATATCGCCTGAGTATCTGGGGATTCTTCAGCACAGGGGATGAACACAGTCGGGGAAACTGGGGTCATTTGGACCAAGTGGCTGCTCTGCATTGGGTCCAGGACAACATTGCCAACTTTGGCGGGGACCCAGGCTCTGTGACCATCTTTGGAGAGTCAGCAGGAGGTTACAGTGTCTCAATTCTTATATTGTCCCCATTGTCCAAGAACCTCTTCCACAGTGCCATTTCTGAGAGTGGTGTGGCCTTCATTCCTGGAATGTTTACCAAAGATGTGAGGCCAATTACTGAGCAAATTGCTGTTACTGCTGGCTGTAAGACCACCACGTCTGCCGTCATTGTTCACTGCATGCGCCAGAAGACGGAGGAGGAGCTATTAGAGATCATGCATAAATTGAATCTGTATAAACTGAGTTTACAAGGAGATACCAAAAATAGCGACCAGTTCGTGACAAGTGTGCTTGATGGAGTGGTGCTACCAAAGGACCCCAAAGAGATCCTGGCTGAGAAGAACTTCAACACTGTGCCTTACATTGTGGGAATCAACAAGCAAGAATGTGGCTGGCTTCTGCCAACAATGACGGGATTTCTACCAGCTGATGTAAAATTGGACAAGAAGAAAGCCATTGCACTCCTGGAGCAATTTGCTTCCATGACTGGCATACCAGAGGATATTATTCCAGTTGCTGTTGAGAAGTACACAAAAGGTAGTGATGACCCTGATCAGATCAGAGAGGGAGTTCTCGACGCAATGGGGGATGTGGCATTTGGTGTTCCATCGGTGATTGTGTCCCGTGGCCACAGAGACACTGGAGCTCCCACCTACATGTATGAGTATCAATACTACCCAAGCTTCTCATCACCCCAAAGACCCAAGAATGTAGTAGGAGACCATGCAGATGATGTCTACTCTGTCTTCGGTGCTCCAATTTTAAGAGAGGGTGCCTCCGAAGAGGAGATCAATCTCAGCAAGATGGTGATGAAATCCTGGGCCAACTTTGCTCGGAATGGGAACCCTAATGGCAAAGGGCTGCCTCATTGGCCAAAGTATGATCAGAAAGAAGGATATCTTCATATTGGTGGCACCACCCAGCAAGCCCAGTGACTGAAGGAGGAGGAAGTGACTTTC

TGGACACAGTCCCTTGCCAAGAAACAACCCCAGCCATACCACAATGAGCTGTGACTCGAG

?????????????????????????????????????????????終止密碼子?Xho?I

（2）.通過EcoR?I和Xho?I進行雙酶切，使Mces1f基因經T4?DNA連接酶作用連接在大腸桿菌高效表達載體PET-32a的EcoR?I和Xho?I酶切位點上構建重組質粒PET-32a-Mces1f，轉化表達宿主菌BL21,進行IPTG誘導表達；此酶是由535個氨基酸殘基組成的，由于選PET-32a作為表達載體，SDS-PAGE顯示分子量為76.9KD，跟預期一樣；

MFLSTLFLVSLATCVICGNPSSPPVVDTAHGKVLGKHVNVEGFSQPVAVFLGIPFAKPPLGSLRFAPPQPAEPWSSVKNATTYPPMCSQDAARGQAVNDLITNRKEKIHLEFSEDCLYLNIYTPADFSKNSRLPVMVWIHGGGLKLGGASSFDGRALSAYENVVVVAIQYRLSIWGFFSTGDEHSRGNWGHLDQVAALHWVQDNIANFGGDPGSVTIFGESAGGYSVSILILSPLSKNLFHSAISESGVAFIPGMFTKDVRPITEQIAVTAGCKTTTSAVIVHCMRQKTEEELLEIMHKLNLYKLSLQGDTKNSDQFVTSVLDGVVLPKDPKEILAEKNFNTVPYIVGINKQECGWLLPTMTGFLPADVKLDKKKAIALLEQFASMTGIPEDIIPVAVEKYTKGSDDPDQIREGVLDAMGDVAFGVPSVIVSRGHRDTGAPTYMYEYQYYPSFSSPQRPKNVVGDHADDVYSVFGAPILREGASEEEINLSKMVMKSWANFARNGNPNGKGLPHWPKYDQKEGYLHIGGTTQQAQ

采用Ni-柱親和層析，對Mces1f的表達產物進行了純化，獲得了高純度90%以上的Mces1f。