[發明專利]靶向基因shRNA干擾豬藍耳病病毒增殖的轉基因細胞系的建立方法

無效

• 申請號: 201210365489.3
• 申請日: 2012-09-27
• 公開（公告）號: CN102876699A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 繆云根;周芳
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N5/10;A61P31/14;C12R1/91
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

1）、設計靶向基因shRNA：

ORF6-6e：

5'-gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg-----3'

3'-----gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActtaa-5'；

2）、構建重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA：

通過PCR擴增zsGFP和NEO片段，將ORF6-6e?所述的shRNA酶切（EcoRI-BamHI

）連接到pMD18-T?Simple載體上，并通過BglII-EcoRV酶切，回收、連接到PXL-BAC2載體上，?構建了重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA。

2.靶向基因shRNA干擾豬藍耳病病毒增殖的轉基因細胞系的構建方法，其特征在于：設計能有效阻止豬藍耳病病毒增殖和復制的靶向基因shRNA，并通過轉座子載體插入供體細胞的基因組，從而獲得能有效阻止藍耳病病毒感染的克隆細胞系。

3.根據權利要求2所述的轉基因細胞系的構建方法，其特征在于：利用重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA進行細胞轉染，包括以下步驟：

將重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA用lipofectin2000轉染試劑轉染Marc-145細胞；

到細胞增長接近匯合時按1：10密度傳代，繼續培養；培養基為含有10%胎牛血清的DMEM基本培養基；

待細胞密度增至50％～70％匯合時，加入G418濃度為1200μg/ml的篩選培養基，每3~5天更換一次G418濃度為1200μg/ml的篩選培養基；當有超過80%的細胞死亡時，改用G418濃度為600μg/ml的篩選培養基維持篩選，每3~5天更換一次G418濃度為600μg/ml的篩選培養基，篩選10～14天后，有抗性的克隆細胞出現，改用含有10%胎牛血清的DMEM基本培養基進行培養，待克隆細胞逐漸增大后，將克隆細胞經胰酶消化后利用有限稀釋法篩選陽性細胞單克隆；從而獲得靶向基因shRNA干擾豬藍耳病病毒增殖的轉基因細胞系；

上述培養和篩選的條件均為：于37℃，5%?CO₂培養箱中培養；

G418濃度為1200μg/ml的篩選培養基的制備方法為：培養基中加入G418直至G418的濃度為1200μg/ml，該培養基為含有10%胎牛血清的DMEM基本培養基；

G418濃度為600μg/ml的篩選培養基的制備方法為：培養基中加入G418直至G418的濃度為600μg/ml，該培養基為含有10%胎牛血清的DMEM基本培養基。

4.根據權利要求2或3所述方法構建而得的靶向基因shRNA干擾豬藍耳病病毒增殖的轉基因細胞系的用途，其特征是：對PRRSV型病毒具有抑制作用。