[發(fā)明專利]靶向基因shRNA干擾豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的建立方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210365489.3
• 申請日: 2012-09-27
• 公開（公告）號: CN102876699A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 繆云根;周芳
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N5/10;A61P31/14;C12R1/91
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明設(shè)計(jì)一種抗豬藍(lán)耳病病毒轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建；具體地講，本發(fā)明設(shè)計(jì)能有效阻止豬藍(lán)耳病病毒增殖和復(fù)制的靶向基因shRNA，并通過轉(zhuǎn)座子載體插入供體細(xì)胞的基因組，獲得能有效阻止藍(lán)耳病病毒感染的Marc-145細(xì)胞克隆。?

背景技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合癥于上世紀(jì)80年代末首次在美國發(fā)現(xiàn)，其致病病原為豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRS?virus，PRRSV)，主要造成母豬繁殖障礙和大量仔豬死亡，仔豬發(fā)病率100%，死亡率50%以上，母豬流產(chǎn)率達(dá)30%以上，是一種重要的動物疫病。?

近年豬藍(lán)耳病在我國大面積暴發(fā)，防治高致病性藍(lán)耳病的根本有效措施主要依靠疫苗，但成本高、手續(xù)煩瑣，而且價(jià)格非常昂貴，極大的增加了養(yǎng)殖成本，增加了豬農(nóng)的負(fù)擔(dān)，應(yīng)用范圍受到極大限制。?

豬藍(lán)耳病（PRRS）是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病，死亡率極高，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然國內(nèi)外對PRRS的疫苗研究非常活躍，但到目前為止，仍沒有一種疫苗可對豬體產(chǎn)生完全安全的保護(hù)，普遍存在難以誘發(fā)較早和較高的抗體水平等問題。?

Marc-145細(xì)胞來源于猴腎細(xì)胞，從母細(xì)胞（MA?104細(xì)胞）克隆而得到，可連續(xù)傳代培養(yǎng)。Marc-145細(xì)胞是目前對PRRSV最敏感的細(xì)胞系之一。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的問題是提供一種靶向基因shRNA干擾豬生殖與呼吸綜合癥病毒增殖和復(fù)制的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建方法及相應(yīng)的重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的構(gòu)建方法，為開辟控制豬PRRS感染和減少其危害提供技術(shù)支持。?

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的構(gòu)建方法，包括以下步驟：?

1）、設(shè)計(jì)靶向基因shRNA：?

ORF6-6e：?

5'-gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg-----3'?

3'-----gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActtaa-5'；?

2）、構(gòu)建重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA：?

通過PCR擴(kuò)增zsGFP和NEO片段，將ORF6-6e?所述的shRNA酶切（EcoRI-BamHI?

）連接到pMD18-T?Simple載體上，并通過BglII-EcoRV酶切，回收、連接到PXL-BAC2載體上，?構(gòu)建了重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA。?

本發(fā)明還同時(shí)提供了一種靶向基因shRNA干擾豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建方法：設(shè)計(jì)能有效阻止豬藍(lán)耳病病毒增殖和復(fù)制的靶向基因shRNA（即，ORF6-6e），并通過轉(zhuǎn)座子載體插入供體細(xì)胞的基因組，從而獲得能有效阻止藍(lán)耳病病毒感染的克隆細(xì)胞系。?

作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建方法的改進(jìn)，利用重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，包括以下步驟：?

將重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA用lipofectin2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞；?

到細(xì)胞增長接近匯合時(shí)按1：10密度（即細(xì)胞密度稀釋10倍）傳代，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)基為含有10%（體積濃度）胎牛血清的DMEM（Gibco）基本培養(yǎng)基；即，該培養(yǎng)基的制備方法為：在每升DMEM（Gibco）基本培養(yǎng)基中加入100ml的胎牛血清；?

待細(xì)胞密度增至50％～70％匯合時(shí)，加入G418濃度為1200μg/ml的篩選培養(yǎng)基，每3-5天更換一次G418濃度為1200μg/ml的篩選培養(yǎng)基；當(dāng)有大量細(xì)胞死亡（即超過80%的細(xì)胞死亡）時(shí)，改用G418濃度為600μg/ml的篩選培養(yǎng)基維持篩選（即，將G418濃度減半進(jìn)行篩選）；每3-5天更換一次G418濃度為600μg/ml的篩選培養(yǎng)基；篩選10～14天后，有抗性的克隆細(xì)胞出現(xiàn)，改用含有10%（體積濃度）胎牛血清的DMEM（Gibco）基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（即停藥培養(yǎng)），待克隆細(xì)胞逐漸增大后，將克隆細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后利用有限稀釋法篩選陽性細(xì)胞單克隆；從而獲得靶向基因shRNA干擾豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；?