[發(fā)明專利]用于聯(lián)合檢測三種發(fā)熱伴出疹病毒的液相芯片非診斷性方法及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210365287.9
• 申請日: 2012-09-26
• 公開（公告）號: CN102876807A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉麗娟;楊永莉;王莎莎;王靜
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C40B50/06;G01N21/64
• 代理公司: 北京中創(chuàng)陽光知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11003
• 代理人: 張飆

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種可同時檢測腸道病毒71（Enterovirus?71）、柯薩奇病毒A組16（Coxsackievirus?A?16）和麻疹病毒（Measles?virus）的液相芯片非診斷性方法以及對其液相芯片的制備方法和應(yīng)用。?

背景技術(shù)

發(fā)熱伴出疹癥候群是以發(fā)熱、出疹為主要癥狀，同時伴有其他臨床癥狀的一組疾病。常見的病原體包括腸道病毒71（Enterovirus?71，EV71）、柯薩奇病毒A組16（Coxsackievirus?A?16，CA16）、麻疹病毒（Measles?virus，MV）、風(fēng)疹病毒、登革病毒等。其中，EV71和CA16分別是導(dǎo)致重癥和輕癥手足口病的主要病原體，麻疹病毒是麻疹的主要病原體。這類疾病在潛伏期時就具有傳染性。因此，在疾病的早期開展對該癥候群病原的篩查，對隨后的隔離、采取相應(yīng)的防控措施等具有指導(dǎo)意義。?

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase?chain?reaction）簡稱PCR，是一種模擬天然DNA復(fù)制的體外擴(kuò)增法。PCR技術(shù)的問世給分子診斷帶來一場革命。PCR技術(shù)已經(jīng)成為分子診斷的基礎(chǔ)。目前PCR產(chǎn)物的檢測方法為瓊脂糖凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠僅約可區(qū)分相差100bp的DNA片段。片段長度相差不大或者相等的PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳將無能無力。另外，瓊脂糖凝膠電泳通過紫外光激發(fā)熒光染料產(chǎn)生熒光來判斷是否存在PCR產(chǎn)物，檢測靈敏度相對較低。且瓊脂糖凝膠電泳通過片段的大小對產(chǎn)物進(jìn)行判斷，特異性差，對非特異擴(kuò)增的大小相似的片段不能區(qū)分。而且常用的染料如溴化乙錠等具有致癌性，常操作對身體健康不利。?

液相芯片（liquid?chip），也稱懸浮芯片(suspension?array)，是一種非常靈活的多功能檢測技術(shù)平臺，可以進(jìn)行蛋白、核酸等生物大分子檢測、受體和配體識別分析等研究。液相芯片主要通過偶聯(lián)探針的熒光編碼微球與兩束激光檢測，對被測物定性和定量分析，一個反應(yīng)孔內(nèi)可以完成100種不同的生物學(xué)反應(yīng)。可實現(xiàn)對核酸的多重檢測。?

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測靈敏度高，特異性好，尤其適用于多重PCR產(chǎn)物相似長度片段不易區(qū)分，且理論上可對100種不同的PCR產(chǎn)物進(jìn)行區(qū)分，實現(xiàn)100種不同因子的多重檢測。?

現(xiàn)有的病原檢測技術(shù)受限于多重檢測能力的困境，而許多可疑樣本需要進(jìn)行多病原的篩查，本發(fā)明的目的是通過提供一種聯(lián)合檢測三種病毒的液相芯片非診斷方法及其制備方法和應(yīng)用，為三種發(fā)熱伴出疹病原的快速檢測提供一種靈敏、特異、快速、可靠的方法。?

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：選擇三種病毒的特異基因片段，設(shè)計針對三種病毒的特異性引物；然后設(shè)計位于擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的三種病毒的特異性探針，探針偶聯(lián)不同編號的編碼微球，制備建立出可對以上三種病毒同時檢測的液相芯片方法，在應(yīng)用時，首先使用上述引物對三種病毒進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與偶聯(lián)有探針的編碼微球結(jié)合，再與鏈親和素-藻紅蛋白（SA-PE）反應(yīng)，之后通過懸浮芯片檢測系統(tǒng)（如Luminex?100，Luminex?200，Bio-plex，Liquichip等），實現(xiàn)對三種發(fā)熱伴出疹病毒的一次性檢測。?

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于聯(lián)合檢測三種發(fā)熱伴出疹病毒的液相芯片非診斷性方法，包括：?

1）用帶有生物素標(biāo)記的特異性引物進(jìn)行三種發(fā)熱伴出疹病毒PCR擴(kuò)增；?

2）偶聯(lián)有捕獲探針的編碼微球在一定的條件下捕獲探針特異的與帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物結(jié)合；?

3）加入鏈霉親和素－藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結(jié)合，利用懸浮芯片Luminex系統(tǒng)進(jìn)行檢測，通過激發(fā)微球基質(zhì)上的紅色分類熒光和微球表面經(jīng)特異性反應(yīng)結(jié)合上的藻紅蛋白，對待檢測物進(jìn)行定性和定量分析。?

進(jìn)一步，所述發(fā)熱伴出疹病毒包括腸道病毒71（EV71）、柯薩奇病毒A組16（CA16）和麻疹病毒（MV）。?

進(jìn)一步，所述EV?71、CA16和MV的引物序列為：?

進(jìn)一步上述序列中Reverse?5’端加Biotin標(biāo)記。?