[發(fā)明專利]用于聯(lián)合檢測(cè)三種發(fā)熱伴出疹病毒的液相芯片非診斷性方法及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210365287.9
• 申請(qǐng)日: 2012-09-26
• 公開（公告）號(hào): CN102876807A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉麗娟;楊永莉;王莎莎;王靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C40B50/06;G01N21/64
• 代理公司: 北京中創(chuàng)陽(yáng)光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11003
• 代理人: 張飆

1.一種用于聯(lián)合檢測(cè)三種發(fā)熱伴出疹病毒的液相芯片非診斷性方法，其特征在于，該非診斷性方法包括：

1）用帶有生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行發(fā)熱伴出疹病毒多重PCR擴(kuò)增；

2）偶聯(lián)有捕獲探針的編碼微球在一定的條件下，捕獲探針特異的與帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物結(jié)合；

3）加入鏈霉親和素-藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結(jié)合，利用懸浮芯片Luminex系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)激發(fā)微球基質(zhì)上的紅色分類熒光和微球表面經(jīng)特異性反應(yīng)結(jié)合上的藻紅蛋白，對(duì)待檢測(cè)物進(jìn)行定性和定量分析。

2.如權(quán)利要求1所述的非診斷性方法，其特征在于，所述發(fā)熱伴出疹病毒包括腸道病毒71、柯薩奇病毒A組16和麻疹病毒。

3.如權(quán)利要求2所述的非診斷性方法，其特征在于，所述腸道病毒71、柯薩奇病毒A組16和麻疹病毒的引物序列為：

。

4.如權(quán)利要求3所述的非診斷性方法，其特征在于，所述引物序列中Reverse?5’端加Biotin標(biāo)記。?

5.如權(quán)利要求1所述的非診斷性方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：cDNA模板2ul，PCR預(yù)混液15ul，各病毒上下游引物（10umol/L）1ul，去離子水補(bǔ)足30ul。反應(yīng)條件：50℃30min；94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

6.一種用于聯(lián)合檢測(cè)三種發(fā)熱伴出疹病毒的液相芯片非診斷性方法其液相芯片的制備方法，該方法包括：

1）根據(jù)待檢測(cè)的PCR產(chǎn)物，選擇設(shè)計(jì)位于擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的特異的捕獲探針；

2）捕獲探針和互補(bǔ)探針合成；

3）相應(yīng)的捕獲探針偶聯(lián)編碼微球；

4）捕獲探針偶聯(lián)微球的驗(yàn)證。

7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述EV?71、CA16和MV的捕獲探針及其互補(bǔ)序列序列為:

。

8.如權(quán)利要求7所述的，其特征在于，所述序列中每個(gè)probe?5’端加12個(gè)C或20個(gè)T再加-NH2修飾；RC-probe?5’端加Biotin標(biāo)記。

9.如權(quán)利要求6所述的液相芯片制備方法，其特征在于，所述步驟2）中探針與微球偶聯(lián)時(shí)的方法，包括以下步驟：

a)分別選取不同編號(hào)的編碼微球，用漩渦振蕩器振蕩微球懸液，使微球?混合均勻；

b)分別取上述微球大約1.25ⅹ10⁶個(gè)，分別轉(zhuǎn)移至離心管，14000g離心3～5min，小心吸出上清；

c)加入50μL0.1mol/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液，振蕩20～30S,超聲20～30s，使微球重懸；

d)用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針稀釋到0.1mmol/L；

e)將1～5μL稀釋的探針加于微球懸浮液中，振蕩混勻；

f)加入2.5μL新鮮配制的10mg/mL的EDC溶液至微球與探針混和液中，振蕩混勻；

g)用鋁箔包裹離心管避光，漩渦振蕩器上400～600rpm振蕩，室溫孵育30min；

h)再次加入新鮮配制的10mg/mL?EDC；

i)再次在漩渦振蕩器上400～600rpm振蕩，室溫避光孵育30min；

j)用0.02%PBST?1ml洗滌1次，離心14000g?3～5min；

k)移棄上清，微球重懸于1ml?0.1%SDS中，洗滌，離心；

l)移棄上清，微球重懸于100μL?pH8.0TE中，振蕩懸起混勻，即得到偶聯(lián)好的檢測(cè)微球。

10.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟4）中偶聯(lián)微球的驗(yàn)證方法，包括以下步驟：

1)取已經(jīng)偶聯(lián)好的檢測(cè)探針每種各3500個(gè)于雜交液中，使其總量為33μL，根據(jù)微球計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算相應(yīng)加入量；

2)向各管中加5～17μL帶有生物素標(biāo)記的互補(bǔ)探針鏈，使其終體積為50μL，吹打混勻；

3)92℃~95℃變性10min；

4)雜交溫度下雜交一定時(shí)間；

5)轉(zhuǎn)移至濾板抽濾去掉未結(jié)合的互補(bǔ)探針鏈；

6)再向各孔加75μL?4ng/μLSA-PE的1×TMAC液，室溫避光孵育10min，抽濾去掉未結(jié)合的SA-PE；

7)再向各孔加入75μL1×TMAC溶液，振蕩使微球重懸；

8)反應(yīng)結(jié)束后，Luminex?system進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)激發(fā)微球基質(zhì)上的紅色分類熒光，對(duì)微球的編號(hào)進(jìn)行識(shí)別；通過(guò)激發(fā)微球表面的藻紅蛋白，讀取熒?光強(qiáng)度MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)；

9)結(jié)果判定：空白對(duì)照MFI低于100，包被微球MFI大于2000的可使用；若包被微球MFI小于2000，則說(shuō)明包被不成功。?