[發(fā)明專利]一種細(xì)胞滅活疫苗、卵黃抗體及卵黃抗體的注射液和凍干粉

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210364920.2
• 申請(qǐng)日: 2012-09-27
• 公開（公告）號(hào): CN102861327A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳紅云;郭俊清;徐進(jìn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鄭州后羿制藥有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/12
• 分類號(hào): A61K39/12;A61K39/42;A61K9/08;A61K9/19;A61P31/20;C12N7/01;C07K16/08;C07K16/02;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種細(xì)胞滅活疫苗、卵黃抗體及卵黃抗體的注射液和凍干粉，屬于疾病免疫領(lǐng)域。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒2型（PVC2）是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥和腎病皮炎綜合癥的主要病原，同時(shí)該病還會(huì)造成免疫抑制，容易造成其他疾病的繼發(fā)或并發(fā)感染，具有高發(fā)生率、高流行性、高致病性、高死亡性等特點(diǎn)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PVC2的致病機(jī)制尚不清楚，其對(duì)豬免疫系統(tǒng)的破壞被認(rèn)為是引起相關(guān)豬病的主要原因。由于免疫力下降，豬在應(yīng)激和病原感染時(shí)容易遭受其他病原侵襲，其臨床癥狀主要為進(jìn)行性消瘦、貧血和黃疸。現(xiàn)在防治手段有抗病毒藥、中藥等，但效果不佳。

雞卵黃抗體IgY是雞的一種免疫球蛋白Ig，雞IgY在功能上相當(dāng)于哺乳動(dòng)物IgG，但結(jié)構(gòu)上有所不同，具有典型的的免疫球蛋白的空間構(gòu)象。雞卵黃抗體具有很多優(yōu)越性：（1）由于鳥類與哺乳類動(dòng)物種系發(fā)生學(xué)的差距，鳥類更適于生產(chǎn)抗哺乳動(dòng)物抗原的特異性抗體。卵黃抗體不會(huì)激發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)，不與抗哺乳動(dòng)物抗原的抗體發(fā)生反應(yīng)，不與哺乳動(dòng)物和細(xì)菌的Fc受體結(jié)合，這在免疫診斷中具有重要意義。（2）卵黃抗體作為一種具有生物活性的免疫球蛋白，在貯存、生產(chǎn)、加工、攝食及消化過程中保證其穩(wěn)定性是非常關(guān)鍵的。多項(xiàng)試驗(yàn)表明，雞IgY具有較好的穩(wěn)定性，耐酸、耐堿、耐熱。卵黃抗體較易保存，4℃條件下存放5年或室溫條件下存放6個(gè)月對(duì)抗體活性無明顯影響。（3）卵黃抗體量大，成本低，便于規(guī)?；a(chǎn)。卵黃中抗體濃度能長期維持在相當(dāng)于甚至超過血清抗體濃度的水平上。1只產(chǎn)蛋雞（以平均每周產(chǎn)蛋5~6枚，平均每枚雞蛋蛋黃大約15mL計(jì)算）所產(chǎn)蛋生產(chǎn)的抗體量相當(dāng)于90~100mL血清或180~200mL血液中抗體的量，例如1只兔子1個(gè)月可提取IgG約200mg，而1個(gè)月1只蛋雞可從蛋中提取IgY2000mg以上。此外，在實(shí)際生產(chǎn)中，動(dòng)物的采血不僅對(duì)動(dòng)物本身是極大的應(yīng)激，而且費(fèi)時(shí)、費(fèi)工，大規(guī)模生產(chǎn)是不切實(shí)際的，而利用蛋雞生產(chǎn)抗體要方便的多。總的來講，卵黃抗體對(duì)動(dòng)物沒有毒副作用，用高免卵黃抗體治療動(dòng)物疾病不但避免了高免血清價(jià)格昂貴、產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，而且可以避免高免血清在治療過程中引起的副作用，是一種很有前途的新型免疫球蛋白制劑。目前卵黃抗體的制備及生產(chǎn)工藝已經(jīng)成熟，可以保質(zhì)保量的生產(chǎn)，卵黃抗體在禽畜疾病診斷、治療和預(yù)防的應(yīng)用越來越多。但是，目前抗豬圓環(huán)病毒2型疫苗的治療比較單一，而且卵黃抗體制備方法繁瑣，抗體的損失較高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞滅活疫苗。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案提供一種細(xì)胞滅活疫苗，由以下方法制備獲得：

1）取病料制成勻漿，反復(fù)凍融后以10000-12000rpm離心15-20min，取上清液，過濾，接種敏感單層PK-15細(xì)胞；

2）將PK-15細(xì)胞連續(xù)傳代，細(xì)胞凍融，提取PCV2病毒的DNA，針對(duì)PCV2病毒ORF1基因，由具有序列表中SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2的核苷酸序列以及SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4的核苷酸序列組成的兩對(duì)特異性PCR引物對(duì)目的基因擴(kuò)增；

3）擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入PMD-18T載體進(jìn)行測序，鑒定；

4）篩選多個(gè)具有抗原免疫活性的病毒表位，經(jīng)過特異引物PCR、產(chǎn)物電泳、測序、克隆、純化、檢測每個(gè)表位的蛋白免疫活性，選擇5個(gè)抗原表位點(diǎn)；

5）將5個(gè)抗原表位點(diǎn)連接，插入到鵝圓環(huán)病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株基因中，然后病毒在敏感性細(xì)胞PK-15單層上傳代，獲得免疫原性的毒株；

6）擴(kuò)大增殖，用IPMA法測定病毒效價(jià)；

7）當(dāng)病毒在PK-15細(xì)胞中傳代表現(xiàn)穩(wěn)定細(xì)胞病變出現(xiàn)規(guī)律，種毒的毒價(jià)穩(wěn)定在10^3.9TCID₅₀/1.0ml，收集細(xì)胞，甲醛滅活加弗式佐劑制得細(xì)胞滅活疫苗。

所述的步驟1）中細(xì)胞反復(fù)凍融3次。

所述的步驟1）中過濾采用0.22μm濾膜。

所述的步驟2）中PK-15細(xì)胞連續(xù)傳代6代，步驟5）病毒在細(xì)胞PK-15單層上傳代45代。

本發(fā)明的目的還在于提供一種細(xì)胞滅活疫苗制備的卵黃抗體。

本發(fā)明的技術(shù)方案還在于提供一種細(xì)胞滅活疫苗制備的卵黃抗體，由以下方法制備獲得：

1）用細(xì)菌滅活疫苗，每間隔7-10天對(duì)健康產(chǎn)蛋雞群進(jìn)行基礎(chǔ)免疫、加強(qiáng)免疫和強(qiáng)化免疫三次免疫，加強(qiáng)免疫后開始檢測抗體效價(jià)，當(dāng)豬圓環(huán)病毒抗體效價(jià)達(dá)1：64、鵝圓環(huán)病毒抗體效價(jià)達(dá)1：64以上時(shí)，收集高免蛋；

2）清理、消毒高免蛋，晾干，無菌術(shù)取卵黃，得到卵黃原液；