[發(fā)明專利]一種細(xì)胞滅活疫苗、卵黃抗體及卵黃抗體的注射液和凍干粉

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210364920.2
• 申請(qǐng)日: 2012-09-27
• 公開（公告）號(hào): CN102861327A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳紅云;郭俊清;徐進(jìn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鄭州后羿制藥有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/12
• 分類號(hào): A61K39/12;A61K39/42;A61K9/08;A61K9/19;A61P31/20;C12N7/01;C07K16/08;C07K16/02;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種細(xì)胞滅活疫苗，其特征在于，由以下方法制備獲得：

1）取病料制成勻漿，反復(fù)凍融后離心，10000-12000rpm離心15-20min，取上清液，過濾，接種敏感單層PK-15細(xì)胞；

2）將PK-15細(xì)胞連續(xù)傳代，細(xì)胞凍融，提取PCV2病毒的DNA，針對(duì)PCV2病毒ORF1基因，由具有序列表中SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2的核苷酸序列以及SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4的核苷酸序列組成的兩對(duì)特異性PCR引物對(duì)目的基因擴(kuò)增；

3）擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入PMD-18T載體進(jìn)行測(cè)序，鑒定；

4）篩選多個(gè)具有抗原免疫活性的病毒表位，經(jīng)過特異引物PCR、產(chǎn)物電泳、測(cè)序、克隆、純化、檢測(cè)每個(gè)表位的蛋白免疫活性，選擇5個(gè)抗原表位點(diǎn)；

5）將5個(gè)抗原表位點(diǎn)連接，插入到鵝圓環(huán)病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株基因中，然后病毒在敏感性細(xì)胞PK-15單層上傳代，獲得免疫原性的毒株；

6）擴(kuò)大增殖，用IPMA法測(cè)定病毒效價(jià)；

7）當(dāng)病毒在PK-15細(xì)胞中傳代表現(xiàn)穩(wěn)定細(xì)胞病變出現(xiàn)規(guī)律，種毒的毒價(jià)穩(wěn)定在10^3.9TCID₅₀/1.0ml，收集細(xì)胞，甲醛滅活加弗式佐劑制得細(xì)胞滅活疫苗。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞滅活疫苗，其特征在于，所述的步驟1）中細(xì)胞反復(fù)凍融3次。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞滅活疫苗，其特征在于，所述的步驟1）中過濾采用0.22μm濾膜。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞滅活疫苗，其特征在于，所述的步驟2）中PK-15細(xì)胞連續(xù)傳代6代，步驟5）病毒在細(xì)胞PK-15單層上傳代45代。

5.一種如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞滅活疫苗制備的卵黃抗體，其特征在于，由以下方法制備獲得：

1）用細(xì)菌滅活疫苗，每間隔7-10天對(duì)健康產(chǎn)蛋雞群進(jìn)行基礎(chǔ)免疫、加強(qiáng)免疫和強(qiáng)化免疫三次免疫，加強(qiáng)免疫后開始檢測(cè)抗體效價(jià)，當(dāng)豬圓環(huán)病毒抗體效價(jià)達(dá)1：64、鵝圓環(huán)病毒抗體效價(jià)達(dá)1：64以上時(shí)，收集高免蛋；

2）清理、消毒高免蛋，晾干，無菌術(shù)取卵黃，得到卵黃原液；

3）向卵黃原液中加入等體積的無菌水，攪拌混勻至顏色發(fā)白，得到卵黃溶液；

4）將卵黃溶液放入60-65℃水浴鍋內(nèi)均勻加熱30min，然后加入pH4.9-5.2溫度4-6℃的酸化水溶液，加入量為卵黃溶液體積的6倍，混勻，靜置沉淀，取上清液，15000rpm離心20min，取上清液；

5）向上清液中加入辛酸，辛酸加入量為溶液體積的0.8-1.0%，混勻，靜置，棄去雜質(zhì)漂浮物，20000rpm離心10min，取上清液，靜置；

6）用0.45μm的濾膜對(duì)步驟5）所得上清液過濾，得到卵黃抗體溶液，再經(jīng)型號(hào)MCW300KD的濾膜過濾，得到精制的含有卵黃抗體的溶液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種卵黃抗體，其特征在于，所述的步驟1）中基礎(chǔ)免疫接種細(xì)菌滅活疫苗的量為1.5ml，強(qiáng)化免疫和強(qiáng)化免疫接種加量1倍。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種卵黃抗體，其特征在于，所述的步驟4）中酸化水溶液是鹽酸配制的酸化水，預(yù)冷時(shí)間為1-2h。

8.一種含有如權(quán)利要求5所述的卵黃抗體的注射液，其特征在于，包括卵黃抗體溶液1份、甲醛0.002-0.003份和硫柳汞0.0001-0.0002份。

9.一種含有如權(quán)利要求5所述的卵黃抗體的凍干粉，其特征在于，包括卵黃抗體溶液1份、甲醛0.002-0.003份、硫柳汞0.0001-0.0002份、葡萄糖0.03-0.04份、山梨醇0.01-0.02份、甘氨酸0.02-0.03份和甘露醇0.02-0.03份。