[發明專利]一種肽的固相合成方法及其合成的肽

無效

• 申請號: 201210364825.2
• 申請日: 2012-09-26
• 公開（公告）號: CN102875639A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 王宇恩;陳永漢;劉劍;馬亞平;袁建成
• 申請（專利權）人: 深圳翰宇藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K1/06
• 分類號: C07K1/06;C07K1/04;C07K14/00
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

1.一種含不對稱二硫鍵的肽的合成方法，其包括以下步驟：

(1)合成與固相載體2-CTC樹脂相連接的肽，所述肽包含三個或三個以上的半胱氨酸或高半胱氨酸的殘基，其中兩個所述半胱氨酸或高半胱氨酸的側鏈各自被S-烷基-硫基保護基團保護，其中所述烷基為未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其鹵代變體或鹵素進一步取代，其中兩個保護基為相同或不同，其中其余的半胱氨酸或高半胱氨酸的側鏈被三苯甲基-、叔丁基-、乙酰氨基甲基-、烷基化的乙酰氨基甲基-、烷基化的三苯甲基-保護基團保護，

(2)使所述肽與S-烷基-硫基保護基團去除劑反應，

(3)使所述肽在氧氣存在下且在無非均相催化劑存在下形成不對稱二硫鍵，

(4)裂解肽樹脂得到含不對稱二硫鍵的肽。

2.權利要求1的合成方法，其中所述方法包括在步驟(4)后采用HPLC方法純化所述肽，最終得到精肽；優選所述純化方法為：將所述肽經過濾后用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以三氟乙酸水溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，其中流動相A相為體積比為0.1％TFA水溶液，B相為純乙腈。

3.權利要求1的合成方法，其中在步驟(1)中用于合成肽的偶聯劑包括選自以下的一種或多種：混合酸酐、活化的酯或酰基鹵、碳二亞胺、活化的苯并三嗪衍生物、苯并三唑的脲鎓或鏻鹽衍生物、BOP、PyBOP、PyAOP、HCTU、TCTU、HATU、TATU、TOTU、HAPyU，或其混合物；步驟(1)優選在堿存在下發生反應，所述堿優選為N，N-二異丙基乙胺、N，N’-二烷基苯胺、2，4，6-三烷基吡啶或N-烷基嗎啉，其中所述烷基是直鏈或支鏈C₁-C₄烷基，更優選為N-甲基嗎啉或2，4，6-三甲基吡啶，最優選為2，4，6-三甲基吡啶；步驟(1)優選使用偶聯添加劑，特別是苯并三唑類的偶聯添加劑，優選為N-羥基苯并三唑衍生物或N-羥基苯并三嗪衍生物，更優選為N-羥基丁二酰亞胺、N-羥基-3，4-二氫-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪、1-羥基-7-氮雜苯并三唑和N-羥基苯并三唑，最優選為N-羥基苯并三唑；步驟(1)優選使用20％哌啶/N-甲基嗎啉溶液，20％哌啶/DMF溶液，進行堿不穩定性Nα的脫保護，尤其用于固相合?成中N-末端的Fmoc或Boc保護。

4.權利要求1的合成方法，其中步驟(1)中的所述肽具有至少另一種側鏈保護基團，包括Trt、tBu、Pbf、OtBu、Acm、Boc；優選地，所述S-烷基-硫基保護基團為S-叔丁基硫基保護基團；優選地，步驟(1)所得的肽的替代度范圍可小于0.5mmol/g，優選為0.1-0.5mmol/g，更優選為0.3mmol/g。

5.權利要求1的合成方法，其中所述肽中半胱氨酸或高半胱氨酸被至少3個殘基隔開，優選被至少5個殘基隔開；優選地，所述肽包括2-100個氨基酸殘基；優選地，所述高半胱氨酸的側鏈包括2-15個亞甲基和1個巰基。

6.權利要求1的合成方法，其中所述S-烷基-硫基保護基團去除劑為三烷基膦或巰基試劑，優選為三正丁基膦或硫醇類；其中所述三烷基膦或硫醇類的投料倍數優選大于10倍，更優選為10倍-100倍，最優選為50倍。

7.權利要求1的合成方法，其中步驟(2)的溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、異丙醇、N-甲基吡咯烷酮，或其混合物，優選N，N-二甲基甲酰胺/異丙醇混合液(混合比優選為10∶1)；步驟(2)優選在惰性氣體保護下進行反應，所述惰性氣體優選為氮氣、氬氣，更優選為氮氣。

8.權利要求1的合成方法，其中步驟(3)的溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、二氯亞砜，或其混合物，優選DMF和DCM的混合液(混合比優選為4∶1)；步驟(3)優選在堿存在下發生反應，所述堿可為堿性鹽(如乙酸鈉)或胺，優選為胺，更優選為叔胺，最優選為三乙胺；步驟(3)中所述的氧氣優選是鼓泡到反應液體中的；步驟(3)的所述非均相催化劑可為炭；步驟(3)的反應時間優選為10h-40h，更優選為20h-35h，最優選為30h。