[發(fā)明專(zhuān)利]一種肽的固相合成方法及其合成的肽

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210364825.2
• 申請(qǐng)日: 2012-09-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102875639A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王宇恩;陳永漢;劉劍;馬亞平;袁建成
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K1/06
• 分類(lèi)號(hào): C07K1/06;C07K1/04;C07K14/00
• 代理公司: 北京北翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含不對(duì)稱(chēng)二硫鍵的肽的固相合成方法，以及由此方法合成的肽。

背景技術(shù)

二硫鍵(disulfide)在蛋白質(zhì)及多肽分子中對(duì)保持其生物活性和構(gòu)象穩(wěn)定有著舉足輕重的作用。含有二硫鍵的小分子肽通過(guò)溶液法或固相合成法合成時(shí)，通常是將脫保護(hù)的線(xiàn)性肽鏈中的兩個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基的巰基氧化成二硫鍵。兩個(gè)半胱氨酸形成一個(gè)二硫鍵的方法有很多，例如，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN102336808A報(bào)道了一種奧曲肽二硫鍵氧化環(huán)合的方法，其采用醋酸銨緩沖液作為氧化工作液，在pH?7.5-8.5下，將合成的奧曲肽前體直八肽氧化成環(huán)八肽，所述方法氧化條件溫和，副反應(yīng)少，產(chǎn)物純度高，最后產(chǎn)品收率高，適用于規(guī)模化生產(chǎn)。當(dāng)多肽分子含多對(duì)Cys殘基時(shí)，二硫鍵的形成受許多因素影響，可能導(dǎo)致形成多種異構(gòu)體，產(chǎn)物的產(chǎn)率降低，且給分離純化帶來(lái)許多麻煩。

現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有不對(duì)稱(chēng)二硫鍵的合成方法，而實(shí)際多肽藥物中有許多含有不對(duì)稱(chēng)二硫鍵的藥物。因此，需要一種含不對(duì)稱(chēng)二硫鍵的肽的合成方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種含不對(duì)稱(chēng)二硫鍵的肽的合成方法，其包括以下步驟：

(1)合成與固相載體2-三苯甲基氯樹(shù)脂相連接的肽，所述肽包含三個(gè)或三個(gè)以上的半胱氨酸或高半胱氨酸的殘基，其中兩個(gè)所述半胱氨酸或高半胱氨酸的側(cè)鏈各自被S-烷基-硫基保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，其中所述烷基為未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其鹵代變體或鹵素進(jìn)一步取代，其中兩個(gè)保護(hù)基為相同或不同，其中其余的半胱氨酸或高半胱氨酸的側(cè)鏈被三苯甲基-、叔丁基-、乙酰氨基甲基-、烷基化的乙酰氨基甲基-、烷基化的三苯甲基-保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，

(2)使所述肽與S-烷基-硫基保護(hù)基團(tuán)去除劑反應(yīng)，

(3)使所述肽在氧氣存在下且在無(wú)非均相催化劑存在下形成不對(duì)稱(chēng)二硫鍵，

(4)裂解肽樹(shù)脂得到含不對(duì)稱(chēng)二硫鍵的肽。

此外，本發(fā)明還提供一種合成的含不對(duì)稱(chēng)二硫鍵的肽，其具有以下通式：

其中，m，n＝1或2，其中Y＝H或Y是第一保護(hù)基團(tuán)，o為0-50，x為2-50，q＝0-50，其中R₁(o)、R₂(x)、R₃(q)各自獨(dú)立地是選自以下的氨基酸的側(cè)鏈：天然氨基酸，包括環(huán)氨基酸；非天然氨基酸，包括環(huán)氨基酸或非酰氨結(jié)合的二肽基區(qū)段，天然氨基酸的非天然衍生物或其類(lèi)似物，其中所述氨基酸鏈各自不包含或包含第二保護(hù)基團(tuán)，各側(cè)鏈的第二保護(hù)基團(tuán)相同或不同，A是樹(shù)脂或樹(shù)脂連接臂，R₁₀、R₁₁各自為烷基，該烷基為未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其鹵代變體或鹵素進(jìn)一步取代，這些烷基相同或不同。

本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，所述方法通過(guò)定位氧化在肽分子中形成不對(duì)稱(chēng)二硫鍵，其定向效率高，因而產(chǎn)生的副產(chǎn)物少。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種含不對(duì)稱(chēng)二硫鍵的肽的合成方法，其包括以下步驟：

(1)合成與固相載體2-三苯甲基氯樹(shù)脂相連接的肽，所述肽包含三個(gè)或三個(gè)以上的半胱氨酸或高半胱氨酸的殘基，其中兩個(gè)所述半胱氨酸或高半胱氨酸的側(cè)鏈各自被S-烷基-硫基保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，其中所述烷基為未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其鹵代變體或鹵素進(jìn)一步取代，其中兩個(gè)保護(hù)基為相同或不同，其中其余的半胱氨酸或高半胱氨酸的側(cè)鏈被三苯甲基-、叔丁基-、乙酰氨基甲基-、烷基化的乙酰氨基甲基-、烷基化的三苯甲基-保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，

(2)使所述肽與S-烷基-硫基保護(hù)基團(tuán)去除劑反應(yīng)，

(3)使所述肽在氧氣存在下且在無(wú)非均相催化劑存在下形成不對(duì)稱(chēng)二硫鍵，

(4)裂解肽樹(shù)脂得到含不對(duì)稱(chēng)二硫鍵的肽。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括在步驟(4)后采用HPLC方法純化所述肽，最終得到精肽；優(yōu)選所述純化方法為：將所述肽經(jīng)過(guò)濾后用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以三氟乙酸(TFA)水溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，其中流動(dòng)相A相為體積比為0.1％TFA水溶液，B相為純乙腈。