[發明專利]一種植物表達載體及培育低植酸水稻的方法

有效

• 申請號: 201210364073.X
• 申請日: 2012-09-26
• 公開（公告）號: CN102864167A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 舒慶堯;李文旭;趙海軍
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于基因工程領域，尤其涉及一種植物表達載體及培育低植酸水稻的方法。

背景技術

植酸(PA，phytic?acid)，又名肌醇六磷酸(myo-inositol-1，2，3，4，5，6-hexakisphosphate，簡寫InsP6或IP6)，廣泛存在于禾谷類、豆類、堅果、油料作物的種子中，是植物磷的主要儲存形式。在植物體內，植酸及其衍生物承擔著多種生理功能，如在種子發育過程中儲藏磷、能量等，在種子萌發時向種子提供無機磷。此外，植酸及其衍生物也參與細胞內的信號轉導、能量轉換、ATP代謝及抗逆性等過程。然而，由于人和非反芻動物(豬、雞、魚等)腸胃內缺乏消化植酸及植酸鹽的相關酶，因此以禾谷類、豆類等為主食的人類和飼用動物的排泄物中磷的含量很高，極易造成環境水體富營養化；同時植酸與Zn²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺等形成的植酸鹽不能被人和非反芻動物所吸收利用，造成這些微營養的生物有效性下降。因此，通過遺傳育種或者基因工程技術獲得植酸含量適當下降、其他農藝性狀沒有顯著變異的作物，不僅能夠提高食物的營養價值，同時對于保護生態環境有重要的社會意義。

V.Raboy等(1996)采用化學誘變劑處理玉米，培育了兩類低植酸突變體lpa1和lpa2，植酸含量分別下降66％和30％。隨后應用γ射線和化學誘變劑在大麥、水稻、小麥、大豆等作物獲得了多種植酸突變體和品種，這些突變體和品種的種子植酸含量下降幅度從30到90％不等。然而研究發現，伴隨著種子中植酸含量下降，作物的其他農藝性狀也會發生改變，如作物減產、種子活力下降、植株形態改變，甚至會影響植物對病原菌的抗性，嚴重的還會導致致死突變。因此，獲得作物種子植酸含量下降而其他農藝性狀沒有顯著變異的低植酸品種成為擺在育種家面前的難題。

到目前為止，植物植酸代謝途徑已經了解比較清楚，參與植酸代謝的多個功能基因已經被報道。包括：將光合作物產物葡萄糖-6-磷酸轉化成1D-肌醇-3-磷酸的MIPS基因；負責肌醇和3-磷酸肌醇之間轉化的MIK和IMP基因；參與肌醇磷酸化的IPK1和IPK2基因；承擔運輸植酸到貯藏小泡的MRP5(水稻)基因；將植酸水解為肌醇和無機磷的植酸酶基因。目前功能研究最為詳細的是MIPS基因，并通過基因沉默技術在多種作物中獲得了相應的低植酸突變體。Ruth?Keller等(1998)應用組成型啟動子和反義RNA技術，獲得了MIPS基因表達水平下降的轉基因土豆，分析發現轉基因土豆葉片中肌醇的含量下降；Aline?C.S.Nunes等(2005)通過RNAi技術沉默MIPS基因使大豆中的植酸含量下降了94.5％；Mio?Kuwano等(2008)通過反義RNA技術在種子特異性啟動子的驅動下，獲得了植酸含量下降、其他農業性狀沒有顯著變異的轉基因水稻。此外，Shi等(2007)應用RNAi技術，在玉米種子特異性啟動子Ole16和Glb驅動下，通過沉默MRP4基因獲得種子植酸含量下降的玉米和大豆。目前還沒有通過RNAi技術沉默其他植酸代謝相關基因，培育低植酸水稻或其他作物的報道。

發明內容

本發明提供了一種植物表達載體，利用該植物表達載體能特異性地抑制水稻種子中相應植酸代謝相關基因MIK的表達，從而獲得性狀穩定的低植酸水稻植株。

一種RNAi抑制水稻MIK基因表達的植物表達載體，包括插入原始載體的發夾結構單元和特異性啟動子，所述特異性啟動子為啟動子Oleosin18，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。MIK基因來自于水稻，其基因序列號；LOC?Os03g52760，其序列如SEQ?ID?No.8所示。

本發明植物表達載體使用種子特異性啟動子Oleosin18，可以使基因沉默事件僅發生在種子胚和糊粉層，能夠有效地避免其他組織部位植酸合成受到影響。

所述發夾結構單元包括中間的內含子及兩端的目的基因片段和目的基因片段的反向互補片段，所述目的基因片段為MIK基因cDNA序列的部分序列，MIK基因的cDNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。內含子在本發明中沒有特異性的要求，它可以來自菜豆亞硝酸還原酶基因(基因序列號：U10419.1)，堿基序列如SEQ?ID?NO.3所示。擴增所述目的基因片段的引物為引物MIKRNAi-F和MIKRNAi-R如下：

MIKRNAi-F：5’-TACTTGAGAAGGCAGTAAAACGAC-3’；

MIKRNAi-R：5’-AGAGCACATAATTCAACAGAGAGC-3’；