[發明專利]一種黑莓組培苗葉片高效循環再生的方法

有效

• 申請號: 201210363956.9
• 申請日: 2012-09-27
• 公開（公告）號: CN102823505A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 王小敏;胡淑英;吳文龍;張春紅;李維林
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種用黑莓組培苗葉片反復循環再生的方法，屬于植物組織培養技術領域。

技術背景

黑莓(Rubus?spp.)為薔薇科懸鉤子屬半灌木漿果類果樹，果實為聚合果，營養豐富，富含糖、果酸及多種維生素，有防衰老和提高人體免疫力等功效，尤其是過氧化物歧化酶(SOD)含量為水果之最，是近年來國內外興起的第三代水果之一，具有很高的經濟價值。優良黑莓品種的培育和推廣具有重要的應用和經濟價值。目前，黑莓育種上多采用實生選優、雜交育種、輻射育種等常規育種手段為主，有一定的局限性，而且選育進程較慢，嚴重制約了黑莓優良品種的快速發展。

隨著分子生物學的發展，基因工程技術為黑莓育種開辟了新途徑。可以通過基因工程的方法，有針對性地引入特定基因，從而獲得具有優良性狀的轉基因植株。而基因成功實現轉化的關鍵在于擁有一個高效而穩定的不定芽離體再生體系。已有的黑莓組織培養的研究中，以莖尖、腋芽培養等快繁研究居多，但這些組織或器官多因取材時間或受農桿菌侵染的限制未能用于實踐。葉片具有易于取材和培養操作的優勢，而組培苗的葉片具有分生能力強、無菌不易污染等特點，有助于提高葉片的再生頻率和遺傳轉化效率。目前黑莓離體再生研究已取得了較好成果，但都是單向的一輪再生方法，國內外尚未見到有通過瓶外一次性取材，而達到瓶內永久循環再生黑莓苗的報道。

發明內容

發明目的：本發明的目的是針對現有黑莓離體再生技術的不足，提供一種利用黑莓試管苗葉片進行植株離體再生的方法，一方面為黑莓基因工程育種提供技術支撐，一方面為規模化生產快速提供優質苗木。

本發明所述循環再生體系是指：通過組織培養的手段，由不同培養階段的不定芽提供葉片，多重循環獲得再生苗的植物組織培養體系。

具體內容：為實現上述目的，本發明采用的解決方案是：(1)瓶外獲得黑莓莖段誘導產生初代試管苗；(2)黑莓試管苗葉片離體再生為完整植株；(3)愈傷組織分化所得不定芽葉片的離體循環再生；(4)繼代增殖所得不定芽葉片的離體循環再生；(5)壯苗培養所得不定芽葉片的離體循環再生。

(1)瓶外獲得黑莓莖段誘導產生初代試管苗的方法是：以黑莓一年生枝條的半木質化莖段為外植體，用濃洗衣液浸泡沖洗后，于體積比為(70～75)％的酒精中浸(30～60)s，用無菌水沖洗3～5次，再用(0.1～0.2)％升汞浸泡(5～8)min；然后將外植體切成(1.0～1.5)cm長的帶芽莖段，接種于不定芽誘導培養基上，培養(20～40)d，進行不定芽的繼代增殖，每隔(20～30)d繼代1次，繼代2次以上的試管芽苗作為葉片離體再生的材料。

所述的莖段誘導不定芽培養基為：MS+6-BA(0～0.5)mg/L+ZT(0.5～1.0)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+瓊脂5.6g/L，pH值5.8～6.2；

所述的不定芽繼代增殖培養基為：MS+6-BA(0～0.2)mg/L+TDZ(0～0.1)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+瓊脂5.6g/L，pH值5.8～6.2；

所述的培養條件為：培養室溫度(25±3)℃，光照度(1500～3000)lx，光照時間(12～14)h/d。

上述解決方案中，誘導莖段形成不定芽的最佳培養基為：MS+6-BA?0.3mg/L+ZT?0.5mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂5.6g/L，ZT濃度過高會使不定芽出現玻璃化，并且抑制不定芽的生長；不定芽繼代增殖最佳培養基為：MS+TDZ0.05mg/L+蔗糖(25～30)g/L+瓊脂5.6g/L。

(2)黑莓組培苗葉片離體再生為完整植株的方法包括以下步驟：

①組培苗及其葉片的選擇：當組培苗長至3葉以上時，選擇最長邊×最寬邊為0.5cm×0.5cm以上的葉片，去掉邊緣，修剪成(0.4～0.8)cm×(0.4～0.8)cm大小的葉塊；

②誘導葉片形成愈傷組織：將步驟①修剪好的葉片在接種時背面緊貼于培養基表面；愈傷組織誘導培養基為：MS+TDZ(0.1～1.0)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+瓊脂5.6g/L，pH值5.8～6.2；培養時先在溫度(25±3)℃的條件下暗培養(10～15)d，當葉片邊緣開始卷曲膨大產生少量愈傷顆粒時，轉到光照度(1000～2000)lx、光照時間(12～14)h/d的條件下，培養(15～20)d后形成淡黃色、致密的愈傷組織；