[發明專利]一種黑莓組培苗葉片高效循環再生的方法

有效

• 申請號: 201210363956.9
• 申請日: 2012-09-27
• 公開（公告）號: CN102823505A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 王小敏;胡淑英;吳文龍;張春紅;李維林
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種黑莓組培苗葉片高效循環再生的方法，其特征在于包括以下步驟：①大田黑莓莖段外植體的獲取、消毒，②莖段不定芽的誘導發生，③不定芽的繼代培養；④不定芽苗葉片的循環使用；⑤不定芽的生根誘導；⑥試管苗的煉苗、移栽。

2.權利要求1所述的步驟①，其特征在于：外植體莖段的獲取、消毒的方法：以黑莓一年生枝條的半木質化莖段為外植體，用濃洗衣液浸泡沖洗后，在體積比為(70～75)％的酒精中浸(30～60)s，用無菌水沖洗3～5次，再用(0.1～0.2)％升汞浸泡(5～8)min。

3.權利要求1所述的步驟②，其特征在于：誘導莖段產生不定芽的方法：將外植體切成(1.0～1.5)cm長的帶芽莖段，接種于不定芽誘導培養基上，培養(20～40)d；所述的誘導莖段形成不定芽的培養基為：MS+6-BA(0～0.5)mg/L+ZT(0.5～1.0)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+瓊脂5.6g/L，pH值5.8～6.2。

4.權利要求1所述的步驟③，其特征在于：不定芽的繼代培養的方法：將步驟②誘導產生的不定芽接種在繼代增殖培養基上增殖，每隔(20～30)d繼代1次；所述的不定芽的繼代增殖培養基為：MS+6-BA(0～0.2)mg/L+TDZ(0～0.1)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+瓊脂5.6g/L，pH值5.8～6.2。

5.權利要求1所述的步驟④，其特征在于包括以下步驟：

(1)組培芽苗及其葉片的選擇：選步驟③中繼代2次以上的組培芽苗作為循環使用的葉片離體再生材料，當組培芽苗長至3葉以上時，選擇最長邊×最寬邊為0.5cm×0.5cm以上的葉片，去掉邊緣，剪成(0.4～0.8)cm×(0.4～0.8)cm大小的葉塊；

(2)誘導葉片形成愈傷組織：將步驟(1)修剪好的葉片背面緊貼于培養基表面，先在溫度(25±3)℃的條件下暗培養(10～15)d，當葉片邊緣開始卷曲膨大產生少量愈傷顆粒時，轉到光照度(1000～2000)lx、光照時間(12～14)h/d的條件下，培養(15～20)d后形成淡黃色、致密的愈傷組織；所述的誘導葉片形成愈傷的培養基為：MS+TDZ(0.1～1.0)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+瓊脂5.6g/L，pH值5.8～6.2；

(3)誘導愈傷組織分化不定芽：將步驟(2)所得愈傷組織取下，切成(0.3～0.6)cm×(0.3～0.6)cm的塊狀，接種到愈傷組織分化培養基上，在培養室溫度(25±3)℃、光照度(1500～3000)lx、光照時間(12～14)h/d的條件下培養(25～35)d；所述的愈傷組織分化的培養基為：MS+6-BA(0.5～2.0)mg/L+TDZ(0～1.0)mg/L+IAA(0～0.5)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+瓊脂5.6g/L，pH值5.8～6.2；

(4)不定芽的繼代增殖：將步驟(3)獲得的不定芽轉接于繼代增殖培養基中，在培養室溫度(25±3)℃、光照度(1500～3000)lx、光照時間(12～14)h/d的條件下培養(20～30)d；所述的不定芽繼代增殖培養基為：MS+6-BA(0.5～2.0)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+瓊脂5.6g/L，pH值5.8～6.2；

(5)不定芽的壯苗培養：將步驟(4)中株高大于1.5cm的不定芽轉接于壯苗培養基中，在培養室溫度(25±3)℃、光照度(1500～3000)lx、光照時間(12～14)h/d的條件下培養(15～20)d；所述的不定芽壯苗的培養基為：MS+6-BA(0.3～0.5)mg/L+NAA(0.05～0.2)mg/L+蔗糖(20～25)g/L+瓊脂5.6g/L，pH值5.8～6.2。

6.權利要求1所述的步驟④中愈傷組織分化所得不定芽苗的葉片離體循環再生，其特征在于：選擇繼代2?次以上的組培芽苗的葉片作為循環使用的離體再生材料。

7.權利要求1所述的步驟④中壯苗培養所得不定芽苗的葉片離體循環再生，其特征在于：選擇壯苗培養所得優質不定芽苗的葉片作為循環使用的離體再生材料。