[發明專利]一種通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法

在審

• 申請號: 201210363098.8
• 申請日: 2012-09-26
• 公開（公告）號: CN103667248A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 張麗麗;于新令;王鳳灘
• 申請（專利權）人: 山東方明藥業集團股份有限公司
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N15/01;C12P19/62
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技術領域

本發明涉及一種通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，屬于生物工程領域。

背景技術

紅霉素屬大環內酯類抗生素，具有廣譜抗菌作用。對G⁺菌有強大抗菌作用，尤其對耐青霉素的金葡菌有效。對立克次體、支原體、螺旋體有較強的抑制作用。對阿米巴原蟲、滴蟲也有抑制作用。

紅霉素是白色或類白色的結晶性粉末，微有吸濕性，味苦，易溶于醇類、丙酮、氯仿、酯類（如乙酯、丁酯、戊酯等），微溶于乙醚。紅霉素在水中極微溶解，其溶解度隨溫度的升高而減小，以55℃時為最小。

紅霉素是從紅霉素鏈霉菌的培養液中分離出來的一種堿性抗生素，我國于1957年試制成功后并逐步投入生產。后來從發酵液中分離出來紅霉素A、B、C、D、E等組分，其中以紅霉素A為主要組分，抗菌活性強、且毒副作用較小；其它組分抗菌活性弱，而毒副作用又較A大。

紅霉素B的理化性狀與紅霉素A很相似，溶點為198℃，紫外吸收峰在286nm（甲醇）處。比較難溶于水，極易溶于乙醚、丙酮、氯仿和乙酸乙酯，并且和酸類結合成的鹽易溶于水。

通常所稱的紅霉素即指紅霉素A及其鹽類。但是在紅霉素生產中，發酵液中同時含有紅霉素A、B、C、D、E等組分，這為后續的提純處理增加了困難，而且紅霉素B的含量控制是產品質量控制的重要指標。國內外抗生素工業發展歷史證明，菌種的不斷更新換代，是生產水平大幅度提高，是抗生素工業迅速發展的關鍵之一。由于新的高產菌株不斷用于生產，所以青霉素、鏈霉素、土霉素、四環素、卡那霉素、慶大霉素、頭孢菌素C等產品的發酵單位，都比他們的原始菌種提高幾十倍、幾百倍、甚至幾千倍，與此同時，菌種選育在提高產品質量、擴大品種、改善工藝條件等方面也發揮了重大作用。菌種選育是抗生素工業生產及科研工作的主要環節，既是關鍵又是基礎。

根據誘發突變機理，利用物理或化學的因素處理微生物群體細胞，使其中部分細胞的遺傳物質發生改變，從而引起微生物的性狀變異。然后從群體中挑選出少數具有優良性狀的菌株。經特性考察和復試用于生產，這個過程稱為誘變育種。誘變育種的主要環節是：以合適的誘變劑處理大量而分散的微生物細胞（一般處理孢子懸液），在引起絕大多數細胞致死的同時，使變異率大大提高，然后通過有效的篩選方法淘汰負變菌株，留用變異幅度最大的正變菌株。目前誘變育種是提高菌種生產能力、提高產品質量、擴大品種和簡化工藝的主要育種方法。

紅霉素是紅霉素生產菌在發酵過程中產生的一種次級代謝產物，隨著發酵周期的延長，紅霉素在發酵液中含量逐步增多，與此同時，其他次級代謝產物也在不斷的積累，這些都使發酵液中的環境越來越不利于菌體產素，對產量的提高有著較大的制約。紅霉素生產菌經過誘變后，利用含有紅霉素的培養基篩選，篩選出的菌體對自身所產紅霉素的耐受程度提高，從而使菌體的產素能力以及產量得到提高。誘變后的菌株用于生產，發酵液中A組分含量提高，B組分含量降低，為發酵液的后續處理帶來了極大的方便，降低了雜質含量，使產品質量得到提高。

發明內容

目前，提高紅霉素生產菌產紅霉素的能力，仍以誘變育種為主要手段。針對現有技術中存在的問題，本發明提供一種通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法。

本發明的一種通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，其包括以下步驟：

（1）將紅霉素生產菌在斜面培養基上培養，培養6-7天后獲得新鮮成熟孢子；

（2）將紅霉素生產菌新鮮成熟斜面制成孢子懸液，孢子量在1×10⁶個/mL，取5mL孢子懸液移至培養皿中，于15W紫外線燈管和固定距離20cm照射2分鐘，誘變后進行梯度稀釋立即涂培養基平板；

（3）挑取步驟（2）誘變后活菌落進行離子束輻照誘變：誘變溫度為25℃，誘變劑量為50Gy，誘變后進行梯度稀釋涂培養基平板初篩。挑單菌落至斜面培養基，34±1℃，培養6-7天，再經搖瓶發酵方法進行復篩，所得突變菌即為高產紅霉素生產菌。

（4）步驟（1）或步驟（3）斜面養基的配方為：可溶性淀粉6g，玉米漿7.2g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g。步驟（2）的平板培養基的配方為：可溶性淀粉6g，玉米漿7.2g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，紅霉素標準品15g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g。