[發(fā)明專利]低密度脂蛋白膽固醇定量法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210362275.0
• 申請(qǐng)日: 2009-03-06
• 公開（公告）號(hào): CN103060426A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫國(guó)敬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/60
• 分類號(hào): C12Q1/60;C12Q1/44;C12Q1/28;C12Q1/26
• 代理公司: 北京戈程知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00910117837.3，申請(qǐng)日為2009年3月6日，發(fā)明名稱為“高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇定量法”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及對(duì)低密度脂蛋白膽固醇的改良的測(cè)定方法及相關(guān)試劑盒。

背景技術(shù)

血漿中膽固醇的存在和運(yùn)輸形式為血漿脂蛋白，即血漿中非極性的脂類包括膽固醇和親水性的載脂蛋白結(jié)合，使得脂蛋白有較強(qiáng)的水溶性可以在血中運(yùn)輸。血漿脂蛋白可以分為高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜顆粒四種，其中低密度脂蛋白主要負(fù)責(zé)將膽固醇運(yùn)輸至外周組織，而高密度脂蛋白是清除動(dòng)脈壁上的膽固醇向肝臟運(yùn)輸。流行病學(xué)和臨床研究表明，低密度脂蛋白膽固醇水平與動(dòng)脈硬化類疾病冠心病的發(fā)生率成正相關(guān)，高密度脂蛋白膽固醇與動(dòng)脈硬化類疾病冠心病的發(fā)生率成負(fù)相關(guān)，即具有抗動(dòng)脈硬化活性。因此高密度脂蛋白膽固醇HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C是當(dāng)前臨床實(shí)驗(yàn)室血脂測(cè)定中最有價(jià)值的心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素指標(biāo)。

測(cè)定高低密度脂蛋白膽固醇的方法很多，包括超離心法、色譜法、電泳法和沉淀法等。超離心法可作為基本的定量法使用，它使用超速離心機(jī)進(jìn)行分離，根據(jù)比重的差別分離LDL或HDL，進(jìn)而測(cè)定其中的膽固醇含量；而后來(lái)發(fā)展的電泳法以醋酸纖維膜或瓊脂糖凝膠等做載體分離，然后根據(jù)酶法測(cè)定膽固醇含量；在沉淀法中，沉淀劑凝結(jié)除高密度脂蛋白以外的脂蛋白，凝結(jié)的脂蛋白通過(guò)離心分離沉淀，根據(jù)酶反應(yīng)測(cè)定上清即高密度脂蛋白膽固醇的含量；測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇的第一代化學(xué)沉淀法，采用PVS和PEGME沉淀LDL，用離心分離法收集沉淀物，然后根據(jù)酶反應(yīng)測(cè)定其中的膽固醇含量；以上方法均需要特殊儀器，包括超速離心機(jī)、電泳儀和離心機(jī)等，操作復(fù)雜，難于自動(dòng)化，從而無(wú)法在臨床實(shí)驗(yàn)室開展。

發(fā)明內(nèi)容

本方法所涉及的直接定量低密度脂蛋白膽固醇的方法，采用優(yōu)化的PVS沉淀法，僅包裹LDL使其無(wú)法參與酶反應(yīng)，但不會(huì)沉淀LDL即形成不溶物，然后LDL中的膽固醇成分在第一和第二表面活性劑的聯(lián)合作用下直接測(cè)量；詳細(xì)而言，即高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜微粒中的膽固醇在對(duì)低密度脂蛋白以外的脂蛋白膽固醇反應(yīng)性較好的第一表面活性劑的作用下參與膽固醇脂酶反應(yīng)，低密度脂蛋白膽固醇在第二表面活性劑的作用下溶解釋放以進(jìn)行酶反應(yīng)法測(cè)定其膽固醇含量。酶反應(yīng)中第一步產(chǎn)生的過(guò)氧化氫不必使用過(guò)氧化物酶去除，所以在第二步中不必加入抑制過(guò)氧化物酶活性的疊氮鈉。本發(fā)明中可以使用生物防腐劑。本發(fā)明的方法中無(wú)需標(biāo)本前處理即沉淀和離心，可以直接在自動(dòng)生化儀測(cè)定標(biāo)本中的低密度脂蛋白膽固醇。

本發(fā)明所用的優(yōu)化的聚乙烯硫酸三鉀PVS化學(xué)沉淀法即優(yōu)化濃度和比例的PVS和PEGME，在檢測(cè)低密度脂蛋白膽固醇時(shí)，采用優(yōu)化濃度和比例的PVS和PEGME包裹LDL，優(yōu)化后的比例為1：400-500，濃度分別為1-20mg／L和4g-10g／L；同時(shí)為了避免VLDL的共同被包裹，采用能掩蔽二價(jià)陽(yáng)離子的金屬螯合劑包括EDTA或EGTA等，其使用濃度為0.1mM-2mM；其他只要是和低密度脂蛋白親和性較強(qiáng)的化合物，可以是促使其凝聚的聚陰離子、肝素鈉、磷鎢酸、環(huán)糊精硫酸鹽等，或?qū)ζ溆休^強(qiáng)親和力又不導(dǎo)致沉淀產(chǎn)生的皂苷類化合物也可以使用，它們可以單獨(dú)使用或兩種或以上組合使用，這些物質(zhì)的使用量不受特別限制，根據(jù)物質(zhì)種類及組合方式而不同，盡量選用凝結(jié)或混濁少的組合；同時(shí)為了生化儀的維護(hù)要求，盡量不使用或使用低濃度的鎂離子。