[發明專利]一種分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測技術及試劑盒

有效

• 申請號: 201210361822.3
• 申請日: 2012-09-25
• 公開（公告）號: CN102888457A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 龔桂香
• 申請（專利權）人: 江陰天瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 張海文

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測技術。

背景技術

基因芯片也叫DNA芯片、DNA微陣列（DNA?microarray）、寡核苷酸陣列（oligonucleotide?array），該技術系指將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數量和序列信息，來實現對生物樣品快速、并行、高效地檢測或醫學診斷，由于常用硅芯片作為固相支持物，且在制備過程運用了計算機芯片的制備技術，所以稱之為基因芯片技術。

基因芯片技術由于同時將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對樣品大量序列進行檢測和分析，從而解決了傳統核酸印跡雜交（Southern?Blotting?和?Northern?Blotting?等）技術操作繁雜、自動化程度低、操作序列數量少、檢測效率低等不足。而且，通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術具有多種不同的應用價值，如基因表達譜測定、實變檢測、多態性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等。

但是，通常基因芯片在檢測之前，需要對從樣品中獲取的DNA/mRNA樣品必須進行擴增提高閱讀靈敏度。在PCR擴增過程中，必須同時進行樣品標記，標記方法有熒光標記法、生物素標記法、同位素標記法等。而且，在擴增過程中由于DNA的序列差異，所摻入的熒光標記的dCTP不一致，在同樣條件下，G/C含量高的DNA信號明顯強于G/C含量低的DNA。在芯片檢測之前，PCR產物與芯片上的探針進行雜交，所需時間長，不同分子所需雜交條件不一致，誤差大，且由于雜交位于固相表面，所以有一定程度的空間阻礙作用。樣品制備上，當前多數公司在標記和測定前都要對樣品進行一定程度的擴增以便提高檢測的靈敏度，但仍有不少人在嘗試繞過該問題，這包括?Mosaic?Technologies?公司的固相?PCR?擴增體系以及?Lynx?Therapeutics?公司提出的大量并行固相克隆方法，兩種方法各有優缺點，但目前尚未取得實際應用。

鏈置換等溫擴增技術是近幾年發展起來的一種酶促DNA體外等溫擴增方法，即，具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒定溫度下用非熱變性的方法解開DNA雙鏈的，在延伸新鏈的同時將下游舊鏈剝離的一種新的擴增方式。

分子信標是一種設計巧妙的熒光探針。在長度為15-30?mer寡核苷酸探針的兩端分別加上5-8?mer序列互補的莖桿區。在自由狀態時由于莖桿區互補序列的結合使探針分子形成發夾狀結構，所以又被稱為發夾探針。探針的5'端及3'端分別標記熒光素分子及淬滅劑分子。自由狀態時，發夾結構的兩個末端靠近，使熒光分子與淬滅分子靠近(約為7-10?nm)，此時發生熒光共振能量轉移，熒光分子發出的熒光被淬滅分子吸收并以熱的形式散發，熒光幾乎完全被猝滅，熒光本底極低。當分子信標與序列完全互補的靶標分子結合形成雙鏈雜交體時，信標莖桿互補區被拉開，熒光分子和淬滅分子距離增大，熒光分子所產生的熒光不能被淬滅分子所吸收，發射熒光。且所檢測到的熒光強度與溶液中靶標的量成正比。分子信標技術以其操作簡單、靈敏度高、特異性強、可對核酸進行實時定量測定、甚至可以用于活體分析等特點不僅在生物學研究中有著廣泛的應用，而且在疾病基因檢測與診斷等生物醫學基礎和臨床研究中也將充當重要的角色。

發明內容

本發明的目的在于提供一種分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測技術

本發明所采用的技術方案是：

一種采用分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測目標DNA/RNA的方法，包括如下步驟：

（1）分子信標的設計：分子信標包括環狀區、5’莖桿區和3’莖桿區；其中，環狀區能與目標DNA/RNA特異結合，5’莖桿區的序列比3’莖桿區長出8～25個堿基，標記為5’莖桿區延長段，5’莖桿區連接環狀區部分的序列與3’莖桿區序列互補，使得形成發夾結構；分子信標3’端修飾有熒光分子；?

（2）芯片點樣與鏈置換等溫擴增反應：將分子信標5’端固定到固相支持物表面，形成分子信標微陣列芯片，然后將淬滅探針及樣品DNA/RNA與芯片進行雜交，洗滌，然后將鏈置換等溫擴增反應液、引物加到微陣列芯片上，等溫擴增目的基因；

或者是：將分子信標與淬滅探針混合，點樣固定到固相支持物表面，形成分子信標微陣列芯片，然后將鏈置換等溫擴增反應液、引物及樣品DNA/RNA加到微陣列芯片上，等溫擴增目的基因；

所述淬滅探針為5’端修飾有熒光淬滅基團的寡核苷酸序列，至少有8個堿基與5’莖桿區延長段互補，優選為12個堿基；所述引物與3’莖桿區互補；