[發(fā)明專利]一種分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測技術及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210361822.3
• 申請日: 2012-09-25
• 公開（公告）號: CN102888457A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發(fā)明（設計）人: 龔桂香
• 申請（專利權）人: 江陰天瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 張海文

1.一種采用分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測目標DNA/RNA的方法，包括如下步驟：

（1）分子信標的設計：分子信標包括環(huán)狀區(qū)、5’莖桿區(qū)和3’莖桿區(qū)；其中，環(huán)狀區(qū)能與目標DNA/RNA特異結合，5’莖桿區(qū)的序列比3’莖桿區(qū)長出8～25個堿基，標記為5’莖桿區(qū)延長段，5’莖桿區(qū)連接環(huán)狀區(qū)部分的序列與3’莖桿區(qū)序列互補，使得形成發(fā)夾結構；分子信標3’端修飾有熒光分子；?

（2）芯片點樣與鏈置換等溫擴增反應：將分子信標5’端固定到固相支持物表面，形成分子信標微陣列芯片，然后將淬滅探針及樣品DNA/RNA與芯片進行雜交，洗滌，然后將鏈置換等溫擴增反應液、引物加到微陣列芯片上，等溫擴增目的基因；

或者是：將分子信標與淬滅探針混合，點樣固定到固相支持物表面，形成分子信標微陣列芯片，然后將鏈置換等溫擴增反應液、引物及樣品DNA/RNA加到微陣列芯片上，等溫擴增目的基因；

所述淬滅探針為5’端修飾有熒光淬滅基團的寡核苷酸序列，至少有8個堿基與5’莖桿區(qū)延長段互補；所述引物與3’莖桿區(qū)互補；

（3）對擴增結果進行熒光數(shù)值分析，根據(jù)熒光值，確定樣品DNA是否為目標DNA及其含量。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，分子信標的環(huán)狀區(qū)為長度15～30個堿基的序列；5’莖桿區(qū)和3’莖桿區(qū)的互補序列長5～11個堿基。

3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子信標的5’端連接有10～30個胸腺嘧啶或腺嘌呤。

4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子信標的5’末端修飾氨基，固相支持物表面修飾醛基。

5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，分子信標3’端標記的熒光分子為FAM、HEX、TET、FITC、Cy3、Cy5、Cy5.5、PE、TAMRA、ROX、Texas?Red、AMCA、JOE、rhodamine、bodipy、Alexa?dye等有機熒光染料或量子點等無機染料中的任一種；淬滅探針上的熒光淬滅基團為P-苯二胺(Para-phenylene?diamine，PPD)、n-丙基沒食子酸鹽（propyl?gallate，NPG）、1，4-二偶氮雙環(huán)（2，2，2)-辛烷(1，4-diazobicyelo(2，2，2)-octane，DABCO)、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、Eclipse、Iowa?Black、納米金顆粒中的任一種。

6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相支持物為玻片、塑料片、微球、磁珠中的任一種。

7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述鏈置換等溫擴增反應液的組成為：50mM?Tris-HCl?pH?7.0~8.0，1.5?mM?MgSO₄，10?mM二硫蘇糖醇（DTT），50～400?μM每種dNTP，20?μg/ml?BSA，25～100?U/ml?DNA聚合酶。

8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，可在鏈置換等溫擴增過程中，所加入的dCTP用熒光標記。

9.一種分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測試劑盒，包括固定在固相支持物表面的分子信標、淬滅探針、引物、鏈置換等溫擴增反應液，其中：

所述分子信標包括環(huán)狀區(qū)、5’莖桿區(qū)和3’莖桿區(qū)；其中環(huán)狀區(qū)能與目標DNA/RNA特異結合，5’莖桿區(qū)的序列比3’莖桿區(qū)長出8～25個核苷酸，標記為5’莖桿區(qū)延長段，5’莖桿區(qū)靠近環(huán)狀區(qū)部分的序列與3’莖桿區(qū)序列互補與3’莖桿區(qū)序列互補，使得形成發(fā)夾結構；分子信標的3’端修飾有熒光分子；

所述淬滅探針為5’端修飾有熒光淬滅基團的寡核苷酸序列，至少8個堿基與5’莖桿區(qū)延長段互補；

所述引物與3’莖桿區(qū)互補。

10.根據(jù)權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述鏈置換等溫擴增反應液的組成為：50mM?Tris-HCl?pH?7.0~8.0，1.5?mM?MgSO₄，10?mM二硫蘇糖醇（DTT），50～400?μM每種dNTP，20?μg/ml?BSA，25～100?U/ml?DNA聚合酶。