[發(fā)明專利]一種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210361582.7
• 申請日: 2012-09-25
• 公開（公告）號: CN102864230A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設計）人: 李相昆;儲昭瑞;張杰
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 王艷萍

技術領域

本發(fā)明涉及一種分析厭氧氨氧化菌群的方法。

背景技術

厭氧氨氧化菌(ANAMMOX)是最新發(fā)現(xiàn)的浮霉菌門(Planctomycetes)的一員，屬于嚴格厭氧自養(yǎng)菌，它能以氨氮(NH₄⁺)為電子供體，亞硝氮(NO₂^-)為電子受體，將氨氮(NH₄⁺)和亞硝氮(NO₂^-)直接轉變成氮氣(N₂)。厭氧氨氧化菌的發(fā)現(xiàn)，對于研究地球氮循環(huán)、豐富微生物理論以及開發(fā)新型生物脫氮工藝均具有巨大的推動作用。目前，已證明厭氧氨氧化菌廣泛分布于海洋、湖泊、河流底泥、地下水以及許多污水處理裝置中，并在地球氮循環(huán)中起著舉足輕重的作用，據(jù)報道，其氮氣產(chǎn)量占海洋氮氣產(chǎn)量的30％-50％^[2，3]。許多水處理專家將其應用到污水脫氮工藝中，解決了傳統(tǒng)硝化-反硝化工藝中的不足，有著良好的推廣應用前景。

按照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》第2版的細菌分類方法，厭氧氨氧化菌被確定為浮霉菌門(Planctomycetes)的一員。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化菌有五個屬，分別是CandidatusKuenenia、CandidatusBrocadia、CandidatusAnammoxoglobus、CandidatusJettenia、CandidatusScalindua。

在對環(huán)境樣品中厭氧氨氧化菌的群落組成分析時，人們常常通過克隆、測序構建16SrDNA克隆文庫的方法。雖然這種方法避免了對厭氧氨氧化菌純培養(yǎng)的要求，但是構建克隆文庫工作量大，費用高，不能實現(xiàn)厭氧氨氧化菌的快速分析。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的分析厭氧氨氧化菌群的方法工作量大，費用高，不能實現(xiàn)厭氧氨氧化菌的快速分析的問題，提供一種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法。

本發(fā)明快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，按以下步驟進行：

一、使用試劑盒提取待分析樣品的DNA；

二、特異性PCR擴增：以樣品的DNA為模板，以Pla46F和630R為引物，進行第一次PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物A，將擴增產(chǎn)物A經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得純化產(chǎn)物，然后以純化產(chǎn)物為模板，以AMX368F和AMX820R為引物，進行第二次PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物B；

三、限制性內(nèi)切酶酶切：將擴增產(chǎn)物B經(jīng)1U的綠豆核酸酶消化30min，消化后的擴增產(chǎn)物B采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，然后使用MspI和RsaI對純化的擴增產(chǎn)物B進行雙酶切，獲得酶切產(chǎn)物；

四、酶切產(chǎn)物純化：向酶切產(chǎn)物中加入1μL?3mol/L、pH為5.2的NaAc溶液和20μL-20℃、體積濃度為96％的乙醇溶液，然后于10000rpm離心，棄上清，向沉淀中加入體積濃度為70％的乙醇溶液清洗，然后于10000rpm離心，取沉淀，干燥后加入5μL滅菌超純水溶解沉淀；

五、毛細管電泳：將1μL步驟四中溶解的沉淀、9μL甲酰胺和0.25μL?DNA分子量內(nèi)標-500混勻后，用DNA測序儀進行毛細管電泳，電泳程序：①變性，90℃，120sec；②進樣，2.0kV，30sec；③分離，5.0kV，60℃，60min，電泳結果即為酶切后末端片段的長度；

六、毛細管電泳結果分析：依據(jù)下述對應關系，

將DNA測序儀獲得的電泳結果數(shù)據(jù)采用GeneMapper?4.0進行分析，即獲得厭氧氨氧化菌群分析結果；其中步驟二中引物Pla46F為5’-GGATTAGGCATGCAAGTC-3’，引物630R為5’-CAKAAAGGAGGTGATCC-3’，引物AMX368F為5’-TTCGCAATGCCCGAAAGG-3’，引物AMX820R為5’-AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3’。

本發(fā)明通過模擬PCR和模擬酶切，以美國國家生物技術信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫為對象，得出了不同厭氧氨氧化菌屬所對應的理論末端片段長度。本發(fā)明方法無需克隆、測序，直接通過對酶切后末端片段長度(T-RFs)的分析，即可完成對樣品中厭氧氨氧化菌群的快速分析，減小了工作量，降低了成本。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

(1)本發(fā)明避免了通過克隆，測序建立16S?rRNA基因克隆文庫來分析厭氧氨氧化菌群結構的繁瑣步驟，實現(xiàn)了厭氧氨氧化菌群組成的快速分析。