[發明專利]一種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法

無效

• 申請號: 201210361582.7
• 申請日: 2012-09-25
• 公開（公告）號: CN102864230A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 李相昆;儲昭瑞;張杰
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 王艷萍

1.一種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，其特征在于快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，按以下步驟進行：

一、使用試劑盒提取待分析樣品的DNA；

二、特異性PCR擴增：以樣品的DNA為模板，以Pla46F和630R為引物，進行第一次PCR擴增，獲得擴增產物A，將擴增產物A經DNA純化試劑盒純化，獲得純化產物，然后以純化產物為模板，以AMX368F和AMX820R為引物，進行第二次PCR擴增，獲得擴增產物B；

三、限制性內切酶酶切：將擴增產物B經1U的綠豆核酸酶消化30min，消化后的擴增產物B采用PCR產物純化試劑盒純化，然后使用MspI和RsaI對純化的擴增產物B進行雙酶切，獲得酶切產物；

四、酶切產物純化：向酶切產物中加入1μL?3mol/L、pH為5.2的NaAc溶液和20μL-20℃、體積濃度為96％的乙醇溶液，然后于10000rpm離心，棄上清，向沉淀中加入體積濃度為70％的乙醇溶液清洗，然后于10000rpm離心，取沉淀，干燥后加入5μL滅菌超純水溶解沉淀；

五、毛細管電泳：將1μL步驟四中溶解的沉淀、9μL甲酰胺和0.25μL?DNA分子量內標-500混勻后，用DNA測序儀進行毛細管電泳，電泳程序：①變性，90℃，120sec；②進樣，2.0kV，30sec；③分離，5.0kV，60℃，60min，電泳結果即為酶切后末端片段的長度；

六、毛細管電泳結果分析：依據下述對應關系，

將DNA測序儀獲得的電泳結果數據采用GeneMapper?4.0進行分析，即獲得厭氧氨氧化菌群分析結果；其中步驟二中引物Pla46F為5’-GGATTAGGCATGCAAGTC-3’，引物630R為5’-CAKAAAGGAGGTGATCC-3’，引物AMX368F為5’-TTCGCAATGCCCGAAAGG-3’，引物AMX820R為5’-AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3’。

2.根據權利要求1所述的一種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，其特征在于步驟二中第一次PCR擴增的反應體系為50μL反應體系，由下列成分組成：10～50ng樣品的DNA、1μL引物Pla46F、1μL引物630R、5μL?10×Buffer、4μL?dNTPs、1μL?Taq酶和余量的ddH2O；PCR擴增條件為：94℃變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環，再72℃延伸10min，4℃保溫。

3.根據權利要求1所述的一種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，其特征在于步驟二中第二次PCR擴增的反應體系為50μL反應體系，由下列成分組成：10～50ng純化產物、1μL引物AMX368F、1μL引物AMX820R、5μL?10×Buffer、4μL?dNTPs、1μL?Taq酶和余量的ddH₂O；PCR擴增條件為：94℃變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環，再72℃延伸10min，4℃保溫。

4.根據權利要求1所述的一種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，其特征在于步驟三中雙酶切反應體系為10μL，由下列成分組成：1μL?MspI、1μL?RsaI、1μL?Buffer和7μL純化的擴增產物B，酶切反應條件為37℃反應3h，然后置于65℃20min終止反應。