[發明專利]一種角質酶的分離純化方法

無效

• 申請號: 201210361503.2
• 申請日: 2012-09-26
• 公開（公告）號: CN102839163A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 王秀英
• 申請（專利權）人: 四川金稞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12R1/77;C12R1/66;C12R1/645
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• 代理人: 暫無信息

1.一種角質酶的分離純化方法，其特征在于：

(1)將角質酶發酵液離心去除菌體后，向粗酶液中緩慢加入經研磨烘干后固體硫酸銨，使硫酸銨達到一定濃度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量Tris-HCl緩沖液溶解后，倒入經煮沸處理后的透析袋中，相同緩沖溶液中透析，透析后離心，收集上清液。

(2)向步驟(1)透析后的酶液加入經研磨烘干后的固體硫酸銨至一定飽和度，上樣于經30％硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液預平衡的Phenyl-Sepharose疏水柱，上樣結束后先用30％硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液平衡至A280值不變后，再用30％硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液與不含硫酸銨的Tris-HCl緩沖液線性洗脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液洗脫，流速為2.5mL/min，測定280nm吸收峰處集中管中酶液的活性，對活性較高的收集液進行SDS-PAGE，確認蛋白純度，若SDS-PAGE結果顯示多條蛋白帶，則收集酶活性較高的酶液，進行DEAE-Sepharose弱陰離子交換柱層析。

(3)將步驟(2)酶活較高的收集液濃縮后在Tris-HCl緩沖液中充分透析，加入同種緩沖液平衡的DEAE-Sepharose層析柱中，酶蛋白經緩沖液洗脫至A280不變后，用Tris-HCl緩沖液和含有NaCl的同一洗脫液線性梯度洗脫，流速為2.5mL/min，收集活性峰，即為所制備的電泳純角質酶溶液。

2.根據權利要求1所述的角質酶分離純化方法，其特征在于：角質酶發酵液的來源可以為鐮刀菌屬Fusarium、炭疽菌屬Colletotrichum、鏈核盤菌屬Monilinia、曲霉屬Aspergillus、黑星菌屬Venturia、鏈格孢菌屬Alternaria、葡萄孢菌屬Botrytis、殼二孢屬Ascochyt的真菌發酵。

3.根據權利要求1所述的角質酶分離純化方法，其特征在于：3個步驟所實施的溫度均要求在0-4℃。

4.根據權利要求1所述的角質酶分離純化方法，其特征在于：3個步驟中所述的Tris-HCl緩沖液的pH值范圍為7.0-9.0，其中步驟(1)中Tris-HCl緩沖液的濃度為20-40mM，步驟(2)和(3)中Tris-HCl緩沖液的濃度為8-20mM。

5.根據權利要求l所述的角質酶分離純化方法，其特征在于：步驟(1)中硫酸銨的濃度為90％-95％；透析時間為2-10小時。

6.根據權利要求1所述的角質酶分離純化方法，其特征在于：步驟(2)中向透析后的酶液加入經研磨后烘干的固體硫酸銨至一定飽和度指的飽和度為20％-60％。

7.根據權利要求1所述的角質酶分離純化方法，其特征在于：步驟(3)中NaCl的濃度為0.2-1.0mol/L。