[發明專利]一種篩選人腫瘤相關的自然反義轉錄子的方法

有效

• 申請號: 201210361433.0
• 申請日: 2012-09-25
• 公開（公告）號: CN102827844A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 楊朝輝;何鳳田;張立
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 重慶志合專利事務所 50210
• 代理人: 胡榮琿

技術領域

本發明涉及生物技術、生物醫藥領域，具體地，本發明涉及一種篩選人腫瘤相關自然反義轉錄子的方法。

背景技術

自然反義轉錄子（natural?antisense?transcripts，以下稱NAT）通常是指自然情況下生物體內生成的反義RNA（antisense?RNA），它們與其對應的互補RNA（complementary?RNA）通過互補堿基配對，形成雙鏈的自然正義-反義轉錄子（natural?sense-antisense?transcript，以下稱NSAT），引起靶基因的降解或翻譯抑制來調控靶基因的表達。NAT按照其作用方式分為兩種：大多數NAT來源于與正義轉錄子相同的基因組位點，由編碼正義轉錄子的相對鏈所編碼，稱為順式編碼NAT（cis-NAT），這類分子與靶基因的序列完全互補；與此相反，來源于與正義轉錄子不同的基因組位點的NAT稱為反式編碼NAT（trans-NAT），它們與靶基因序列只是部分互補。

近年人們在研究NAT時發現，NAT表達水平的改變與人類腫瘤的發生和轉移等密切相關，因此，NAT的異常表達被認為是研究腫瘤中不可忽視的重要因素。由于NAT的重要功能，目前國內外的多家研究機構對其進行了深入研究，發現自然界中可能存在的NAT遠遠超出我們最初的預期。這些研究大多采用生物信息學預測的方法，具有方便、快捷等優點，但所得結果不夠可靠，且不能在特定的細胞或組織中系統篩選差異表達的NAT分子。為解決這些方法的局限和不足，我們利用雙鏈RNA分子能夠耐受RNaseI的降解，而單鏈RNA分子會被RNase?I降解的原理，將提取的總RNA用RNase?I酶切后再進行逆轉錄反應，就可以將在細胞內與靶分子以雙鏈的NSAT（natural?sense-antisense?transcripts）形式存在的NAT分子從總RNA中分離出來，而且這種方法排除了人為干擾因素，理論上用該方法得到的NSAT應為自然條件下生物體內真實存在的。運用該原理，結合抑制性消減雜交等實驗方法，我們就可以快速系統地篩選人正常細胞及對應的腫瘤細胞或正常組織及對應的癌組織間差異表達的NAT分子，從而獲得人腫瘤相關的NAT分子。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于RNase保護分析及抑制性消減雜交的人腫瘤相關自然反義轉錄子的新型篩選方法。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種篩選人腫瘤相關的自然反義轉錄子的方法，包含以下步驟：

1）提取人正常細胞和對應的腫瘤細胞總RNA；

2）分別加入過量的DNase?I和RNase?I，酶切步驟1）獲得的人正常細胞及對應的腫瘤細胞總RNA，然后通過酚/氯仿抽提回收；

3）以步驟2）中的雙鏈RNA為模板，以隨機六引物及逆轉錄酶將其反轉錄為cDNA；

4）以隨機六引物為引物，用T4DNA聚合酶催化合成cDNA第二鏈并補平末端；

5）以Rsa?I酶切雙鏈cDNA，得到帶有平末端的酶切產物，回收純化后加雙蒸水；

6）將步驟5）的檢測子cDNA分為兩份，一份連接SEQ?ID?NO:5所示的核苷酸序列，一份連接SEQ?ID?NO:6所示的核苷酸序列；驅動子(Driver)cDNA不連接頭；

7）用T4DNA聚合酶補平粘末端，采用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀純化后，加適量雙蒸水溶解；

8）以正常細胞和癌細胞互為檢測子和驅動子進行雙向抑制性消減雜交；其中在正向消減中，以癌細胞為檢測子，以正常細胞為驅動子；在反向消減中,以正常細胞為檢測子，以癌細胞為驅動子；

9）將步驟8）的雜交產物用緩沖液稀釋后作為模板進行兩輪PCR擴增；PCR的引物核苷酸序列對應于SEQ?ID?NO:5所示的核苷酸序列和SEQ?ID?NO:6所示的核苷酸序列；

10）將步驟9）PCR擴增后的正向和反向消減雜交產物純化，后與pGEM-T載體連接克隆，并分別構建正向和反向cDNA消減雜交文庫，鑒定出陽性克隆后進行測序；

11）根據步驟10）所獲得的測序結果進行分析，確定候選的靶分子。

進一步地，步驟1）之后還包括檢測所提取的總RNA的步驟。

進一步地，步驟3）中酶切條件為37℃水浴中酶切30min。

進一步地，步驟5）中酶切雙鏈cDNA時間為2h。

進一步地，步驟5）中加雙蒸水調整濃度至300ng/μl。

進一步地，步驟9）中兩輪PCR擴增循環次數分別為28和12。