[發明專利]一種篩選人腫瘤相關的自然反義轉錄子的方法

有效

• 申請號: 201210361433.0
• 申請日: 2012-09-25
• 公開（公告）號: CN102827844A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 楊朝輝;何鳳田;張立
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 重慶志合專利事務所 50210
• 代理人: 胡榮琿

1.一種篩選人腫瘤相關的自然反義轉錄子的方法，其特征在于，包含以下步驟：

1）提取人正常細胞和對應的腫瘤細胞總RNA；

2）分別加入過量的DNase?I和RNase?I，酶切步驟1）獲得的人正常細胞及對應的腫瘤細胞總RNA，然后通過酚/氯仿抽提回收；

3）以步驟2）中的雙鏈RNA為模板，以隨機六引物及逆轉錄酶將其反轉錄為cDNA；

4）以隨機六引物為引物，用T4DNA聚合酶催化合成cDNA第二鏈并補平末端；

5）以Rsa?I酶切雙鏈cDNA，得到帶有平末端的酶切產物，回收純化后加雙蒸水；

6）將步驟5）的檢測子cDNA分為兩份，一份連接SEQ?ID?NO:5所示的核苷酸序列，一份連接SEQ?ID?NO:6所示的核苷酸序列；驅動子(Driver)cDNA不連接頭；

7）用T4DNA聚合酶補平粘末端，采用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀純化后，加適量雙蒸水溶解；

8）以正常細胞和癌細胞互為檢測子和驅動子進行雙向抑制性消減雜交；其中在正向消減中，以癌細胞為檢測子，以正常細胞為驅動子；在反向消減中,以正常細胞為檢測子，以癌細胞為驅動子；

9）將步驟8）的雜交產物用緩沖液稀釋后作為模板進行兩輪PCR擴增；PCR的引物核苷酸序列對應于SEQ?ID?NO:5所示的核苷酸序列和SEQ?ID?NO:6所示的核苷酸序列；

10）將步驟9）PCR擴增后的正向和反向消減雜交產物純化，后與pGEM-T載體連接克隆，并分別構建正向和反向cDNA消減雜交文庫，鑒定出陽性克隆后進行測序；

11）根據步驟10）所獲得的測序結果進行分析，確定候選的靶分子。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）之后還包括檢測所提取的總RNA的步驟。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3）中酶切條件為37℃水浴中酶切30min。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5）中酶切雙鏈cDNA時間為2h。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5）中加雙蒸水調整濃度至300ng/μl。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟9）中兩輪PCR擴增循環次數分別為28和12。

7.根據權利要求1所述的方法篩選的人腫瘤相關的自然反義轉錄子在制備檢測腫瘤試劑盒中的應用。

8.根據權利要求1所述的方法篩選的人腫瘤相關的自然反義轉錄子在制備檢測腫瘤制劑中的應用。