[發(fā)明專利]芋螺毒素多肽Eb1.6的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210361425.6
• 申請(qǐng)日: 2012-09-25
• 公開（公告）號(hào): CN102875654A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴秋云;徐艷;董銘心;余碩;劉珠果;王孝花;周尚民;李海濤;代琴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種芋螺毒素多肽Eb1.6的制備方法。

背景技術(shù)

芋螺屬腹足綱軟體動(dòng)物，全世界約有500余種，遍布世界各暖海區(qū)，我國(guó)有芋螺100多種，主要分布在西沙群島、海南島及臺(tái)灣海域。芋螺多肽是由芋螺毒液管和毒囊內(nèi)壁的毒腺所分泌，每種芋螺的毒液中含50-200個(gè)活性多肽，不同品種芋螺所含的活性肽各不相同，即使同種芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差異，理論上估計(jì)約存在5萬(wàn)多種不同活性的多肽（McIntosh?JM，Jones?RM.Toxicon，2001，39：1447-1451.）。α-芋螺多肽（α-CTX）屬于芋螺多肽A超家族，特異作用于肌肉型或神經(jīng)元型nAChRs。絕大多數(shù)α-芋螺多肽含12-18個(gè)氨基酸、兩對(duì)二硫鍵（CCXmCXnC，連接方式為1-3，2-4）。根據(jù)m，n的數(shù)目不同，α-芋螺多肽細(xì)分為α3/5，α4/3，α4/4，α4/6，α4/7亞家族。目前發(fā)現(xiàn)某些α-芋螺多肽具有鎮(zhèn)痛活性，其中α-芋螺多肽Vc1.1(GCCSDPRCNYDHPEICONH2)是來自維多利亞芋螺（Conus?Victoriae），由16個(gè)氨基酸組成，含兩對(duì)二硫鍵（二硫鍵的排列方式為1-3，2-4）（Sandall?et?al.Biochemistry，2003，42：6904-6911.）。研究表明Vc1.1在神經(jīng)性疼痛動(dòng)物模型中表現(xiàn)出了較好的鎮(zhèn)痛活性并具有加速損傷神經(jīng)恢復(fù)的作用（Satkunanathan?et?al.Brain?Res.，2005，1059：149-158），2006年已進(jìn)入臨床研究階段。α-芋螺多肽作用的靶點(diǎn)與傳統(tǒng)鎮(zhèn)痛藥物的靶點(diǎn)不同，且不成癮，這對(duì)開發(fā)新一代鎮(zhèn)痛藥物具有重要意義。

Eb1.6（GCCSNPACMLKNPNLC-NH₂，序列1）來自中國(guó)南海西沙群島黑星芋螺，由-芋螺毒素信號(hào)肽保守序列克隆得到，其序列與已報(bào)道的α-芋螺毒素顯著不同。前期初步研究表明，該肽對(duì)大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用（劉珠果等..型芋螺多肽及其應(yīng)用，中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)枺篫L201010121879.7）。前期合成Eb1.6采用儀器合成，縮合劑為N,N’-二環(huán)己基碳二酰亞胺（DCC）/1-羥基苯并三唑（HOBt），偶合率高。但該方法不利于手工大量合成，因?yàn)榭s合劑DCC反應(yīng)后形成不溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）或二氯甲烷（DCM）的N,N’-二環(huán)己基脲（DCU），給縮合反應(yīng)及樹脂洗滌帶來不便。另外，Eb1.6線性肽折疊成目標(biāo)物質(zhì)采用C18柱反相吸附，乙腈洗脫，成本高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種制備芋螺多肽Eb1.6（GCCSNPACMLKNPNLC-NH₂）的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1）采用縮合劑DIC/HOBt合成Eb1.6線性肽；2）折疊Eb1.6線性肽得到多肽粗品；

3）純化所述多肽粗品；即得到芋螺多肽Eb1.6。

上述方法中，采用縮合劑DIC/HOBt合成Eb1.6線性肽包括如下步驟：先用Fmoc保護(hù)氨基酸、以Rink樹脂為固相載體、DIC/HOBt為縮合劑、哌啶為脫保護(hù)劑，從C端依次偶聯(lián)合成，得到肽樹脂；再將所述肽樹脂裂解得到Eb1.6線性肽。其中，F(xiàn)moc保護(hù)氨基酸為Fmoc-Cys(Trt)–OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH。

上述合成Eb1.6線性肽方法中，摸索選用了縮合劑苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）/HOBt/異丙基二乙胺（DIEA），發(fā)現(xiàn)儀器與手工合成目標(biāo)肽均較雜，產(chǎn)率低。最后采用縮合劑DIC/HOBT，儀器合成與手工合成的效率均很高。

上述合成Eb1.6線性肽方法中，步驟1）中，所述Rink樹脂和每一個(gè)所述Fmoc保護(hù)氨基酸的摩爾比為1:4。

上述方法中，折疊Eb1.6線性肽按照包括如下步驟的方法進(jìn)行：

（a）將Eb1.6線性肽在濃度為0.1-0.3M、pH值為8.0-8.4的緩沖液中折疊；所述緩沖液為碳酸氫銨緩沖液或醋酸銨緩沖液或Tris緩沖液；

（b）將經(jīng)步驟（a）得到的折疊產(chǎn)物經(jīng)AmberliteXAD16大孔吸附樹脂吸附后，用無水乙醇浸洗，收集浸洗產(chǎn)物，即得到多肽粗品。