[發明專利]一種牛CSRP3基因單堿基突變的檢測方法

無效

• 申請號: 201210361163.3
• 申請日: 2012-09-22
• 公開（公告）號: CN103305599A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 劉小林;賀花;張慧林;楊菁;李志雄;牛富彪
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學和生物信息學領域，具體涉及基因單堿基突變的檢測。

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技術領域

本發明屬于分子生物學和生物信息學領域，具體涉及基因單堿基突變的檢測。

背景技術

目前，在家畜的遺傳育種中，應用分子標記的現代育種技術是加快良種選育和提高種群遺傳品質，從而增加家畜生產性能先進的有效的方法。應用分子標記育種首先是在DNA水平上篩查和檢測牛經濟性狀密切相關的遺傳標記；其次是建立其基因多態性的快速檢測方法；然后實現遺傳標記輔助選擇和實現早期診斷選擇。

????SNP的檢測方法有很多種，大多數方法以聚合酶鏈式反應為主要基礎，利用堿基差異造成的DNA片段的各種差異來進行SNP檢測和分析，如下所述：（1）單鏈構象多態性。實驗證明300?bp以下的DNA片段中的單堿基突變，單鏈構象多態性檢測方法檢出率幾乎100%，但300bp以上的片段檢出率則不高，甚至還會出現漏檢的情況；此外，其操作繁瑣，需要特殊儀器；所用試劑包含有硝酸銀和甲醛，易對人體健康造成危害；PCR產物電泳之前需進行特殊處理；電泳溫度高低和凝膠濃度大小等均可影響其靈敏度的高低；實驗重復效果不好。（2）創造酶切位點PCR法。其關鍵環節在于錯配引物的設計，引物只能固定在突變位點的鄰近序列設計。創造酶切位點PCR法穩定性高，結果準確，但是由于人為地引入了錯配堿基，與正常引物相比，其擴增難度很高，擴增效率大大降低，將會直接影響到酶切的結果。(3)綜上所述，以上方法均不是一種檢測SNPs的理想的遺傳標記方法。限制性片段長度多態性，此檢測方法結合PCR產物直接測序法，檢測單堿基突變的效率可以達到100%。此方法的關鍵是使用PCR將編碼區域的序列在不同個體當中進行擴增，擴增的產物進行測序，測序結果與原來序列進行比對分析，以準確確定堿基突變的位置。PCR-RFLP具有快速，準確，方法簡便，重復性高，成本低廉的優點，大量樣本的分析可以用此種方法。

CSRP家族成員在肌肉生長發育過程中均起重要作用。研究表明CSRP3基因（又叫肌肉特異性LIM蛋白（muscle?LIM?protein，MLP）僅在肌中表達，且其表達與肌分化過程相一致，是一個肌發生的正調節因子(Arber?et?al.,?1994）。另有研究表明，CSRP3基因編碼產物MLP可以通過一種物理的方式與肌肉組織基本的螺旋一環一螺旋(bHLH)轉錄因子發生作用，這種作用具有高度的特異性，即MLP不與非肌源性bHLH蛋白或成肌增強因子2發生作用(Kong?et?al.,?1997?)。MLP可能以共激活因子的形式促進肌源性bHLH蛋白與特定DNA調控元件的結合(Kong?et?al.,?1997?)。由此，我們推測該基因可能對牛肌肉生長發育產生影響，值得深入研究。但是到目前為止，有關牛CSRP3基因的研究尚未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種牛CSRP3基因單堿基突變的檢測方法，該檢測方法操作簡單易行，成本低，時間短，重復性高，檢測結果準確，極容易判型，便于推廣應用。

為了實現上述發明目的，本發明是通過以下技術方案來實現，該方法包括以下步驟：

（1）根據牛CSRP3基因在基因組序列中的位置，設計一對基因特異性引物；

所述的一對基因特異性引物如下：

上游引物CSRP3-GSP-F：??5'-?CACAGGTCAGGAATCAAAG?-3'??19bp；

下游引物CSRP3-GSP-R：??5'-?GCAAAGGTCAAACAATAGG?-3'??19bp。

（2）以包含牛CSRP3基因的DNA序列為模板進行PCR擴增；

所述PCR反應體系為15?μL，其中包括2×Reaction?Mix?7.5?μL，ddH₂O?6.1?μL，上游引物CSRP3-GSP-F?0.3?μL，下游引物CSRP3-GSP-R?0.3?μL，Golden?DNA?polymerase?0.3?μL，含CSRP3基因序列的DNA模板0.5?μL。

以上各成分混勻后，進行分裝，每管總體積15?μL。放入PTC-200?PCR擴增儀進行PCR反應，PCR程序為：95℃預變性5?min，94℃變性30?s，60℃退火40?s，72℃延伸40?s，共計36個循環，72℃充分延伸10?min，最后16℃保存待用。