[發(fā)明專利]利用重組枯草芽孢桿菌高效表達(dá)Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脫羧酶

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210360555.8
• 申請(qǐng)日: 2012-09-20
• 公開（公告）號(hào): CN102876704A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 饒志明;李靜靜;張顯;徐美娟;楊套偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/75
• 分類號(hào): C12N15/75;C12N1/21;C12N9/88;C12R1/125;C12R1/445
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

利用重組枯草芽孢桿菌高效表達(dá)Staphyloccocus?aureus?α-乙酰乳酸脫羧酶屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

α-乙酰乳酸脫羧酶(α-acetolactate?decarboxylase，簡(jiǎn)稱為ALDC)能催化雙乙酰的前體物α-乙酰乳酸脫羧形成乙偶姻，避免雙乙酰的生成，它可以縮短啤酒熟化周期，提高生產(chǎn)效率，對(duì)啤酒工業(yè)來說極有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

α-乙酰乳酸脫羧酶主要應(yīng)用于啤酒釀造工業(yè)。在啤酒酵母代謝過程中，α-乙酰乳酸是亮氨酸一纈氨酸生物合成過程的中間產(chǎn)物。大部分α-乙酰乳酸在酵母細(xì)胞內(nèi)代謝形成纈氨酸和亮氨酸，小部分滲漏到細(xì)胞外，進(jìn)入發(fā)酵液中，在胞外經(jīng)非酶氧化生成雙乙酰。在啤酒釀造過程中，雙乙酰是影響啤酒質(zhì)量的關(guān)鍵因素，也是決定啤酒成熟與否的重要指標(biāo)，雖然雙乙酰賦予了啤酒特殊的風(fēng)味，但是其口味閾值比較低(0.02～0.10mg/L)，當(dāng)含量超過0.15mg/L時(shí)就會(huì)給啤酒帶來不愉快的餿飯味，因此在整個(gè)發(fā)酵過程中嚴(yán)格控制雙乙酰的產(chǎn)生量是至關(guān)重要的。α-乙酰乳酸脫羧酶能將啤酒生產(chǎn)過程中雙乙酰的前驅(qū)物質(zhì)α-乙酰乳酸迅速分解為乙偶姻，從而快速地降低啤酒中雙乙酰的含量。

釀酒酵母不含ALDC，很多細(xì)菌中含有該酶。Godtfredsen等測(cè)試的34個(gè)屬79個(gè)種(325株)細(xì)菌中，有ALDC活性的占20個(gè)屬40個(gè)種。α-乙酰乳酸脫羧酶首次于1952年從產(chǎn)氣腸桿菌中分離得到，之后有關(guān)該酶在生物界中的分布及菌種選育得到了廣泛研究。a-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)存在于多種細(xì)菌中，它參與α-乙酰乳酸代謝，將α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為乙偶姻。目前還未在真菌、海藻和原生動(dòng)物等真核生物中發(fā)現(xiàn)該酶的存在。

細(xì)菌中天然存在的ALDC產(chǎn)量很低，要想將該酶應(yīng)用于啤酒工業(yè)，研究ALDC的分子結(jié)構(gòu)以及ALDC基因，進(jìn)行基因的克隆和表達(dá)，提高酶的產(chǎn)量，是一種必然的選擇。隨著對(duì)ALDC分子水平研究的深入，α-乙酰乳酸脫羧酶基因已經(jīng)從多種細(xì)菌中克隆得到，并在大腸桿菌、枯草桿菌和酵母中獲得了不同程度的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要研究內(nèi)容：本發(fā)明利用分子技術(shù)克隆了來自金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus?aureus，縮寫為S.aureus)的α-乙酰乳酸脫羧酶基因在本發(fā)明中簡(jiǎn)稱saald，構(gòu)建重組表達(dá)載體pMA5-saald，并將其轉(zhuǎn)化Bacillus?subtilis?WB600，成功構(gòu)建了基因工程菌pMA5-saald/B.subtilis?WB600將發(fā)酵獲得的α-乙酰乳酸脫羧酶運(yùn)用在啤酒發(fā)酵中，初步探討了其降低雙乙酰含量的能力。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

1.α-乙酰乳酸脫羧酶引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI金黃色葡萄球菌的全基因組核酸序列中saald基因序列，設(shè)計(jì)α-乙酰乳酸脫羧酶的PCR引物P1和P2。

P1：5’-ATCGGATCCATGACGAATGTCTTGTATC-3’BamH?I

P2：5’-TGACTACGCGTCTATTCAGCTTCTCTAATTT-3’Mlu?I

2.重組菌的構(gòu)建

從金黃色葡萄球菌中抽提染色體DNA作為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的引物、PCR擴(kuò)增條件和擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR。采用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。采用下共同的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體pMA5和純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，電泳檢驗(yàn)酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收。將載體和PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶過夜連接。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli?JM109的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取陽性轉(zhuǎn)化子于10mL的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后，將菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。將經(jīng)驗(yàn)證構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pMA5-saald用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至B.subtilisWB600中表達(dá)。轉(zhuǎn)化方法為采用改進(jìn)的Spizizen法。經(jīng)篩選驗(yàn)證獲得陽性轉(zhuǎn)化子，即為重組枯草芽孢桿菌pMA5-saald/B.subtilis?WB600。

3.重組菌α-乙酰乳酸脫羧酶的表達(dá)及酶活測(cè)定