[發明專利]利用重組枯草芽孢桿菌高效表達Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脫羧酶

無效

• 申請號: 201210360555.8
• 申請日: 2012-09-20
• 公開（公告）號: CN102876704A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 饒志明;李靜靜;張顯;徐美娟;楊套偉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12N9/88;C12R1/125;C12R1/445
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• 代理人: 暫無信息

1.一種重組質粒pMA5-saald，其特征是以Staphylococcus?aureus基因組DNA為模板，擴增得到編碼α-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)的基因，將其克隆到枯草芽孢桿菌表達載體pMA5上，獲得重組質粒pMA5-saald。

2.權利要求1所述的基因saald的擴增方法，其特征是基因的克隆根據saald基因的特異性設計引物，P1：5’-ATCGGATCCATGACGAATGTCTTGTATC-3’(BamH?I)，P2：5’-TGACTACGCGTCTATTCAGCTTCTCTAATTT-3’(Mlu?I)；擴增條件：94℃預變性，5min，一個循環；94℃變性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min30s，30個循環；72℃，10min，一個循環；15℃，10min，一個循環。PCR擴增體系：金黃色葡萄球菌染色體DNA?2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP?Mix?4μL，10×Ex?Taq?Buffer?5μL，滅菌的雙蒸水37μL，Ex?Taq?DNA聚合酶1μL，擴增saald基因，大小為705bp。

3.一種高效表達S.aureus?α-乙酰乳酸脫羧酶的重組菌pMA5-saald/B.subtilis?WB600，其特征是構建方法如下：

(1)將含saald基因的重組質粒pMA5-saald通過轉化化學轉化法轉入B.subtilis?WB600中，在含氨芐青霉素的抗性平板上挑取抗性轉化子，提取質粒酶切驗證，得到重組菌pMA5-saald/B.subtilis?WB600；

(2)對上述重組菌進行誘導表達，超聲波破碎后測定ALDC的酶活力，并與對照菌株進行比較，重組菌pMA5-saald/B.subtilis?WB600的酶活力相對較高，重組菌pMA5-saald/B.Subtilis?WB600的總酶活為36000U/L，其胞外、胞內比酶活分別為26500U/L、9500U/L。。重組菌的ALDC酶活力比出發菌S.aureus提高了約1200倍，比宿主菌B.subtilis?WB600提高了約10588倍。

4.重組菌pMA5-saald/B.subtilis?WB600的發酵培養，其特征是經種子活化轉接發酵培養基(大豆蛋白胨10g/L，玉米漿15g/L，尿素3g/L，葡萄糖50g/L，k₂HPO₄·3H₂O?1.7g/L，kH₂PO₄2.3g/L，MgSO₄·7H₂O?0.75g/L，NaCl?5g/L，pH?6.8)，37℃搖床160r/min培養48h，結束發酵，其胞外、胞內比酶活分別為28300U/L、38200U/L，總酶活達66500U/L。