[發(fā)明專利]一種面包乳桿菌菌株及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210359133.9
• 申請日: 2012-09-24
• 公開（公告）號: CN102965301A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設計）人: 張建華;尹麗茸;黃蓓;吳秉宇;李雙雙;林立
• 申請（專利權）人: 上海交通大學;福建天生農業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A23L1/015;C12R1/225
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

技術領域：

本發(fā)明涉及一種微生物菌株，特別涉及一種面包乳桿菌菌株及其應用。

背景技術：

皂苷的毒性主要表現(xiàn)為溶血性，一般認為，溶血性是其苷元可以與紅細胞壁上膽甾醇結合生成不溶于水的復合物沉淀，破壞細胞滲透壓，使紅細胞發(fā)生崩解，進而導致溶血現(xiàn)象。皂苷有無溶血活性與皂苷元有關，活性強弱與糖分子的大小、糖分子之間的連接、糖分子上的取代基等有關，此外還與皂苷的濃度有關。

茶皂素的結構如附圖1所示，屬于三萜類皂苷，由糖體、配基和有機酸組成。從分子結構看，茶皂素是一種非離子表面活性劑。其親水基團是強電負性的含氧基團組成，這些基團集中在茶皂素的糖體配體，有機酸配體及皂苷配基的連接部位，構成親水部分。其中配基是由非極性的碳氫環(huán)鏈構成，在水溶液中呈現(xiàn)憎水的傾向，成為親油的主體，所以茶皂素的結構分為親水和親油兩部分。Sobolewska等在發(fā)表于2010年9月(9卷，3期)《Phytochemistry?Review》(植物化學評論)425-474頁的《Saponins?as?cytotoxic?agents：a?review》(綜述：皂苷--細胞毒素)一文中稱利用酶解法去除皂苷的糖體配體，會降低皂苷的溶血性。酶水解工業(yè)化應用成本較高，如能利用微生物發(fā)酵來降低茶籽粕的毒性，將更有工業(yè)化應用前景。

發(fā)明內容：

本發(fā)明的目的在于提供一種面包乳桿菌菌株，以及利用該菌株進行茶籽粕固態(tài)發(fā)酵脫毒的方法，經發(fā)酵脫毒后的茶籽粕溶血作用明顯下降，降低了茶籽粕的毒性。

為解決上述問題，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種面包乳桿菌菌株，所述菌株的分類命名為：面包乳桿菌(Lactobacillus?crustorum)，保藏編號為CGMCC?No.6304，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址為：北京市朝陽區(qū)北辰兩路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期為2012年6月28日。

所述面包乳桿菌菌株的16s?rDNA堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發(fā)明還公開了所述面包乳桿菌菌株的篩選和應用于茶籽粕發(fā)酵脫毒的方法，包括以下步驟：

1、種子培養(yǎng)：將所述面包乳桿菌菌株于MRS固體培養(yǎng)基上涂布，然后于37℃厭氧培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃培養(yǎng)24h，使菌液的OD₆₀₀值達到0.8，備用，所述種子培養(yǎng)基成分為：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母抽提物5.0g，纖維二糖20.0g，吐溫-801ml，檸檬酸三銨2.0g，K₂HPO₄2.0g，MgSO₄·7H₂O?0.2g，MnSO₄·2H₂O?0.05g，蒸餾水1000ml。

2、茶籽粕9g，加入含葡萄糖1.5％(w/w)、半乳糖1.5％(w/w)和硫酸銨2％(w/w)的pH5.0的磷酸鹽緩沖溶液7.2ml，混合均勻后高壓滅菌備用，得到未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基。

3、按接種量10％(菌液/茶籽粕，ml/g)將步驟1中經種子培養(yǎng)后的所述面包乳桿菌菌株接種于步驟2所述未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中，固液比1∶0.8(w/v)，37℃發(fā)酵36h，得發(fā)酵的固體培養(yǎng)基。

4、茶籽粕發(fā)酵脫毒：往步驟3中所述發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中加入50ml70％(v/v)乙醇，80℃振搖4h，抽濾，濾液旋轉蒸發(fā)濃縮，濃縮至干，將所得產物稱重并用生理鹽水配制成100μg/ml的茶皂素固形物溶液A，備用；往步驟2中所述未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中加入50ml?70％(v/v)乙醇，80℃振搖4h，抽濾，濾液旋轉蒸發(fā)濃縮，濃縮至干，將所得產物稱重并用生理鹽水配制成100μg/ml的茶皂素固形物溶液B，作為對照，備用。

5、溶血實驗驗證發(fā)酵效果：

(1)取血：將肝素鈉和裝有生理鹽水的盛血容器置于冰箱中冷藏15min以上；用75％(v/v)酒精對動物的取血部位進行消毒；用一次性注射器吸取少量的肝素鈉溶液，抗凝1ml血液不少于15IU肝素鈉；用注射器從動物靜脈中取血后，去除針頭，將血慢慢推到裝有冰生理鹽水的試管中，制得血樣。

(2)血樣處理：將所述血樣于4℃冷凍離心，300rmp/5min；離心后去除上清液，保留沉淀，再加入少量4℃生理鹽水，用移液槍輕吹，使血溶解；重復本步驟至所述血樣上清無色，然后用生理鹽水稀釋到2％(v/v)，得稀釋后的血樣。