[發明專利]一種脂肪肉瘤鑒別診斷試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201210357887.0
• 申請日: 2012-09-24
• 公開（公告）號: CN102994631A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 李明;何瑰;陳華云
• 申請（專利權）人: 中山大學達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種輔助脂肪肉瘤鑒別診斷及治療選擇的DDIT3基因重排熒光原位雜交檢測試劑盒，包括：1)雜交緩沖液、熒光標記探針混合物、未標記的競爭性DNA、DAPI復染劑，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其特征在于熒光標記探針混合物包含GSP?DDIT3斷裂探針，每人份熒光標記探針混合物中GSP?DDIT3探針的使用量為1.0μl。

2.根據權利要求1所述試劑盒，其特征還在于未標記的競爭性DNA為Human?COT-1DNA。

3.根據權利要求1所述試劑盒，其特征還在于雜交緩沖液的組分包括去離子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去離子甲酰胺濃度為50％～70％，硫酸葡聚糖濃度為0.1g/ml。

4.根據權利要求1所述試劑盒，其特征還在于DAPI復染劑配制方法為50～250ng?DAPI溶于1ml抗褪色液(10mg/ml對苯二胺/PBS，甘油混合液)。

5.一種制備權利要求1試劑盒所述DDIT3基因重排檢測基因探針的方法：

(1)片段篩選：通過NCBI?Mapview數據庫檢索所有DDIT3基因斷裂點兩端的克隆，并對這些克隆進行篩選，選擇含有DDIT3基因斷裂點兩端區域的最優克隆，編號為RP11-1077C21和CTD-2554O15；

(2)培養鑒定：按照DDIT3篩選確定的克隆編號購買克隆，常規培養，使用針對DDIT3基因斷裂點兩端區域的STS引物進行PCR擴增，并通過2％瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物片段進行分析，從而完成待選DDIT3克隆的鑒定；

(3)探針制備：對鑒定陽性的菌液，進行質粒DNA的提取；通過OD值的測定對質粒DNA進行定量；然后，通過切口平移方法對質粒DNA進行熒光標記；對標記產物進行純化；

(4)探針驗證：使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。

6.根據權利要求5所述制備方法，其特征還在于含DDIT3基因3基因斷裂點兩端的克隆培養和鑒定步驟中使用的STS引物對序列分別為：上游引物5’-CCACCTGGGCTGGACTCTAT-3和下游引物5’-CCCACTTCCTAGGGTTGTTTTG-3’，及上游引物5’-GGCAAACAGAGAAGAACCAGAAA-3’和下游引物5’-ATGGGCTCAGGAAAGTAAAGACC-3’。

7.根據權利要求5所述制備方法，其特征還在于探針制備過程中50μl切口平移體系中DNA聚合酶I使用量在10U～20U間，DNase?I使用量在0.001U～0.01U間。

8.根據權利要求5所述制備方法，其特征還在于探針標記的熒光素為熒光素標記的Spectrum?dUTP。

9.根據權利要求5所述制備方法，其特征還在于探針濃縮方法為乙醇沉淀濃縮，最后使用1～2μl滅菌純化水或Human?Cot-1DNA(1μg/μl)溶解沉淀。