[發(fā)明專利]一種卵巢透明細胞癌診斷試劑盒及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210357881.3
• 申請日: 2012-09-24
• 公開（公告）號: CN102994630A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李明;何瑰;陳華云
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種輔助卵巢透明細胞癌診斷和治療方案選擇的HNF1B基因狀態(tài)熒光原位雜交檢測試劑盒，包括：1)雜交緩沖液、熒光標記探針混合物、未標記的競爭性DNA、DAPI復(fù)染劑，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其特征在于熒光標記探針混合物包含GSPHNF1B探針和17號染色體著絲粒探針，每人份熒光標記探針混合物中GSP?HNF1B和CSP17探針的使用量均為0.5μl。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于未標記的競爭性DNA為Human?COT-1DNA。

3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于雜交緩沖液的組分包括去離子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去離子甲酰胺濃度為50％～70％，硫酸葡聚糖濃度為0.1g/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于DAPI復(fù)染劑配制方法為50～250ng?DAPI溶于1ml抗褪色液(10mg/ml對苯二胺/PBS，甘油混合液)。

5.一種制備權(quán)利要求1試劑盒所述HNF1B基因探針和17號染色體著絲粒探針的方法，如下：

(1)片段篩選：通過NCBI?Mapview數(shù)據(jù)庫檢索所有含有HNF1B基因的克隆，并對這些克隆進行篩選，選擇含有HNF1B基因最優(yōu)的克隆，編號為CTD-2257N17(chr17：36033624..36152533)；通過NCBI?Mapview數(shù)據(jù)庫檢索17號染色體重復(fù)區(qū)域序列，并進行重復(fù)性分析，選擇引物設(shè)計區(qū)域；

(2)培養(yǎng)鑒定：按照HNF1B篩選確定的克隆編號購買克隆(Invitrogen)，常規(guī)培養(yǎng)，使用針對HNF1B基因區(qū)域的STS引物進行PCR擴增，并通過2％瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物片段進行分析，從而完成待選HNF1B克隆的鑒定；CSP17以人基因組DNA為模板，利用設(shè)計的引物對進行PCR反應(yīng)，通過電泳進行鑒定；將目的產(chǎn)物進行克隆、培養(yǎng)，從而完成待選CSP?17片段鑒定；

(3)探針制備：對鑒定陽性的菌液，進行質(zhì)粒DNA的提取；通過OD值的測定對質(zhì)粒DNA進行定量；然后，通過切口平移方法對質(zhì)粒DNA進行熒光標記；對標記產(chǎn)物進行純化；

(4)探針驗證：使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征還在于包含HNF1B基因片段的克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中使用的STS引物對序列分別為：上游引物5’-TGCACAGACTACAACCCTAAACC-3’和下游引物5’-TGTAGCACTGTTGTTCTTTGGG-3’；PCR擴增條件為：94℃5分鐘；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×35循環(huán)；72℃7分鐘。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征還在于制備CSP17探針的引物對序列為：

上游引物5’-TTGTAGAATCTGCGAAGGGAC-3’和下游引物5’-AGTGTTTCCAAACTGCTGAATC-3’；PCR擴增條件為：94℃5分鐘；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×35循環(huán)；72℃7分鐘。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征還在于探針制備過程中50μl切口平移體系中DNA聚合酶I使用量在10U～20U間，DNase?I使用量在0.001U～0.01U間。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征還在于探針標記的熒光素為熒光素標記Spectrum?dUTP。

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征還在于探針濃縮方法為乙醇沉淀濃縮，最后使用1～2μl滅菌純化水或Human?Cot-1DNA(1μg/μl)溶解沉淀。