[發明專利]環脂肽類抗生素及其制備和應用

無效

• 申請號: 201210356785.7
• 申請日: 2012-09-21
• 公開（公告）號: CN102911257A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 黃朝暉
• 申請（專利權）人: 無錫市第四人民醫院
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C12N1/20;C12P21/02;A61K38/08;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 曹祖良

技術領域

本發明涉及一種新的環脂肽類抗生素—環九肽菌素及其制備與應用，屬于生物醫學技術領域。?

背景技術

由于抗生素的廣泛應用或濫用，使得一度在細菌感染性疾病治療中起著顯著作用的抗生素出現了廣泛的失效。許多常見細菌對常用抗生素的耐藥性不斷增強。目前，細菌耐藥性已經嚴重威脅人類的健康。耐甲氧西林金黃葡萄球菌，耐青霉素肺炎鏈球菌以及產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）的大腸埃希菌和克雷伯菌等多重耐藥菌已成為醫院中傳播率和致死率很高的病原體。耐萬古霉素腸球菌（VRE）的快速出現，加劇了人們對致病菌耐藥性問題的擔心。?

另外，隨著免疫抑制劑和廣譜抗生素的廣泛應用，導管、插管、燒傷搶救、放化療和器官移植的推廣，真菌感染的發病率也逐年增加。據不完全統計，近10年來，全身性真菌感染的發病率增加了3～5倍，而且預后差、死亡率高。根據化學結構，可將上市的抗真菌藥分為四大類：丙烯類（特比萘芬）、多烯類（兩性霉素B等）、唑類（伊曲康唑等）、棘白霉素類（卡泊芬凈）等。特比萘芬療效低，不能單獨給藥；多烯類有嚴重的不良反應；唑類僅能抑制而不能殺滅真菌；棘白霉素類雖然對于念珠菌屬以及曲霉菌屬均有效，而且安全性較高，但卻面臨尚無口服劑型和價格昂貴等兩大問題，故而限制了它們在臨床上的應用。?

鑒于此，尋找結構新穎、不易產生交叉耐藥以及適合工業化生產的新型抗生素將是人類面臨的一項長期而艱巨的任務。?

發明內容

本發明的目的是克服上述不足之處，提供一種針對臨床耐藥致病菌，具有潛在醫療應用價值的新的脂肽類抗生素——環九肽菌素的制備方法與應用。?

按照本發明提供的技術方案，一種環脂肽類抗生素，結構簡式如下：?

其中L-Dab為L型2,4-二氨基丁酸，L-Ile為L型異亮氨酸，D-Phe為D型苯丙氨酸，L-Leu為L型亮氨酸，D-Val為D型纈氨酸，L-Thr為L型蘇氨酸。?

所述菌株為類芽孢桿菌（Paenibacillus?ehirnensis?strain?B7），保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期：2012年6月24日，地址：中國武漢武漢大學，保藏號為CCTCC?NO:M?2012244。?

環脂肽類抗生素的制備方法，步驟為：?

（1）培養發酵：將類芽孢桿菌（Paenibacillus?ehirnensis?strain?B7）接種到發酵培養基，得到活化菌株，活化菌株在種子培養基中振蕩培養兩次，得到二?級種子液，二級種子液接入發酵培養基中振蕩培養發酵，得到發酵液，離心、取發酵液上清，去沉淀，先經大孔吸附樹脂吸附，將發酵上清以合適速度流經用蒸餾水平衡好的、裝填有大孔吸附樹脂的層析柱；?

（2）分離純化：待樣品上完后，先分別用蒸餾水和甲醇水溶液沖洗，然后用甲醇水溶液洗脫；收集各洗脫峰，測活，將活性組分濃縮蒸干得到粗品；將粗品用甲醇溶解，離心過濾，用固相萃取柱進一步純化；再用制備型高效液相色譜進行精純，收集活性組分，濃縮、凍干即可得到所述環九肽菌素；?

所述環脂肽類抗生素的制備方法，具體步驟為：?

（1）將保存于-80℃冰箱的甘油管中的類芽孢桿菌（Paenibacillus?ehirnensis?strain?B7）轉接到營養瓊脂培養基上，28～35℃培養24～96h，得到活化菌株；?

營養瓊脂培養基，按如下組成配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL，pH7.2；?

（2）將活化菌株接入盛于250mL三角瓶的50mL種子培養基中，于28～35℃，220rpm振蕩培養24h，即為一級種子液；?

（3）將步驟（2）所得的一級種子液接入盛于500mL三角瓶的200mL種子培養基中，于28～35℃，220rpm振蕩培養24h，即為二級種子液；?

種子培養基為營養肉湯培養基，按如下組成配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，自來水1000mL，pH7.2；?

（4）將步驟（3）所得的二級種子液按體積比5%～10%的接種量接入含500mL發酵培養基的2L三角瓶中，于28～35℃，200rpm振蕩培養96h，獲得發酵液；?