[發(fā)明專利]環(huán)脂肽類抗生素及其制備和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210356785.7
• 申請日: 2012-09-21
• 公開（公告）號: CN102911257A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃朝暉
• 申請（專利權(quán)）人: 無錫市第四人民醫(yī)院
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C12N1/20;C12P21/02;A61K38/08;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 曹祖良

1.一種環(huán)脂肽類抗生素，其特征是：結(jié)構(gòu)簡式如下：

其中L-Dab為L型2,4-二氨基丁酸，L-Ile為L型異亮氨酸，D-Phe為D型苯丙氨酸，L-Leu為L型亮氨酸，D-Val為D型纈氨酸，L-Thr為L型蘇氨酸。

2.一株制備環(huán)脂肽類抗生素的菌株，其特征是：所述菌株為類芽孢桿菌（Paenibacillus?ehirnensis?strain?B7），保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期：2012年6月24日，地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏號為CCTCC?NO：M?2012244。

3.環(huán)脂肽類抗生素的制備方法，其特征是步驟為：

（1）培養(yǎng)發(fā)酵：將類芽孢桿菌（Paenibacillus?ehirnensis?strain?B7）接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，得到活化菌株，活化菌株在種子培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)兩次，得到二級種子液，二級種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)發(fā)酵，得到發(fā)酵液，離心、取發(fā)酵液上清，去沉淀，先經(jīng)大孔吸附樹脂吸附，將發(fā)酵上清以合適速度流經(jīng)用蒸餾水平衡好的、裝填有大孔吸附樹脂的層析柱；

（2）分離純化：待樣品上完后，先分別用蒸餾水和甲醇水溶液沖洗，然后用甲醇水溶液洗脫；收集各洗脫峰，測活，將活性組分濃縮蒸干得到粗品；將粗品用甲醇溶解，離心過濾，用固相萃取柱進一步純化；再用制備型高效液相色譜進行精純，收集活性組分，濃縮、凍干即可得到所述環(huán)九肽菌素。

4.如權(quán)利要求3所述環(huán)脂肽類抗生素的制備方法，其特征是具體步驟為：

（1）將保存于-80℃冰箱的甘油管中的類芽孢桿菌（Paenibacillus?ehirnensis?strain?B7）轉(zhuǎn)接到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28～35℃培養(yǎng)24～96h，得到活化菌株；

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，按如下組成配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL，pH7.2；

（2）將活化菌株接入盛于250mL三角瓶的50mL種子培養(yǎng)基中，于28～35℃，220rpm振蕩培養(yǎng)24h，即為一級種子液；

（3）將步驟（2）所得的一級種子液接入盛于500mL三角瓶的200mL種子培養(yǎng)基中，于28～35℃，220rpm振蕩培養(yǎng)24h，即為二級種子液；

種子培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，按如下組成配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，自來水1000mL，pH7.2；

（4）將步驟（3）所得的二級種子液按體積比5%～10%的接種量接入含500mL發(fā)酵培養(yǎng)基的2L三角瓶中，于28～35℃，200rpm振蕩培養(yǎng)96h，獲得發(fā)酵液；

發(fā)酵培養(yǎng)基按如下組成配制：葡萄糖，0～10g/L；CaCl₂，0.01～0.7g/L；MgSO₄·7H₂O，0.05～1g/L；ZnSO₄，0.005～0.1g/L；NaCl，0.05～0.5g/L；FeSO₄，0.005～0.05g/L；(NH₄)₂SO₄，0.5～4.0g/L；MnSO₄·H₂O，0.001～0.01g/L；KH₂PO₄，?0.5～5g/L；溶劑為蒸餾水，pH?7.0～7.5；

（5）步驟（4）取得的發(fā)酵液轉(zhuǎn)到離心瓶中，平衡后于6500×g離心30min，去除沉淀，得澄清發(fā)酵上清液；

（6）將步驟（5）所得的上清液以10～50mL/min的流速流穿用蒸餾水平衡好的Amberlite?XAD-16層析柱，待樣品上完后分別用蒸餾水及含體積比為45%的甲醇的水溶液各沖洗5個床體積，然后用含體積比為90%的甲醇的水溶液洗脫，收集體積比為90%的甲醇水溶液洗脫的洗脫峰，55～65℃濃縮蒸干，得到粗品1；

（7）將粗品1用甲醇溶解，用0.45μm的濾膜過濾后上樣至用體積比25%的乙腈水溶液平衡好的C-18固相萃取柱，樣品加完后再用體積比為25%的乙腈水溶液沖洗5個床體積，然后用體積比65%的乙腈水溶液洗脫，收集洗脫峰，濃縮蒸干，得到粗品2；

（8）將粗品2用甲醇溶解、12000rpm離心10min，并過0.45μM濾膜后，用制備型HPLC進行分離；分離后A液為含體積比0.1%三氟乙酸的水溶液，B液為色譜純乙腈；洗脫梯度為：在40min時間里B液從體積比15%提高到60%；收集活性部分，55～65℃濃縮、-50℃～-60℃真空冷凍干燥，即得產(chǎn)品環(huán)脂肽類抗生素。