[發明專利]GDSL蛋白在制備脂肪酶中的新用途

無效

• 申請號: 201210356229.X
• 申請日: 2012-09-21
• 公開（公告）號: CN102876643A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 周志剛;何夙旭;徐俐;楊雅麟;張美超;李青
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N1/21;C12N15/55;C12P7/22;C12P7/40;C12P7/54;C12P7/52;C12P7/64;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及GDSL蛋白在制備脂肪酶中的新用途。?

背景技術

脂肪酶(1ipase，triacylglycerolacylhydrolases，EC3．1．1．3)即三酰基甘油酰基水解酶，是工業酶制劑中最重要的酶類之一，能夠在油水界面催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯，同時還能催化酯交換、轉酯、酯合成、醇解、酸解、氨解等多種化學反應，通常具有催化效率高、催化條件簡單的優點。?

目前工業上應用的脂肪酶大多為微生物產生的胞外酶，從反應溫度來說多為中溫酶（最適反應溫度37-40℃），在高溫下反應受到限制。嗜熱酶是指最佳催化溫度60-85℃的酶，具有化學催化劑無法比擬的優點，如催化效率高、作用溫度廣泛（在高溫下的穩定性也較好）、作用pH廣泛等，因而能克服中溫酶(20-55℃)及低溫酶(2-20℃)在應用過程中出現的生物學性質不穩定的現象，可以取代傳統的中溫酶催化及化學催化，為優化工藝流程開辟了一條新途徑。?

利用熱穩定性好的脂肪酶作為生物催化劑具有如下優點：(1)由于該脂肪酶的穩定性高，可在室溫下分離提純和包裝運輸、并能長久保持活性，從而制備脂肪酶的成本降低；(2)對反應器冷卻系統的要求標準低，從而減少了能量消耗，且由于其耐高溫特性，在生產中不需要復雜的冷卻裝置，既節省了開支又降低了冷卻過程對環境造成的污染；(3)隨反應溫度的提高，酶分子運動速度加快，催化能力加強，加快了動力學反應，從而使用效率得到了提高；(4)由于采用高溫反應條件，降低了中溫微生物污染反應體系的危險，從而提高了產物純度，同時高溫反應條件還提高了有機化合物的生物可利用性和可溶性，從而實現了有效的生物修復。?

脂肪酶的熱穩定性問題一直是脂肪酶研究及生產和應用的瓶頸問題，就目前脂肪酶的研究現狀來看，僅通過蛋白質工程來改善脂肪酶特性，遠不能解決各個領域對脂肪酶的要求。因此，尋找發現具有新特性、耐熱、高活力、符合現代生物工程要求的脂肪酶是一項非常有意義的工作。?

發明內容

本發明的目的是提供GDSL蛋白在制備脂肪酶中的新用途。?

本發明提供了GDSL蛋白的應用，為如下（1）或（2）：?

（1）制備脂肪酶；（2）降解脂肪酶的底物；?

所述GDSL蛋白是如下（a）或（b）：?

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；?

（b）將序列表的序列2所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白質。?

應用所述GDSL蛋白降解脂肪酶的底物時，所述降解的反應條件為30-80℃、pH6.5–8.0，所述降解的反應條件優選為65℃、pH7.5。?

所述脂肪酶的底物為對硝基苯基乙酸酯、丁酸對硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕櫚酸酯中的至少一種。?

本發明還保護將重組質粒導入大腸桿菌得到的重組菌；所述重組質粒為將所述GDSL蛋白的編碼基因插入載體pET-28a(+)的多克隆位點得到的重組質粒。?

所述GDSL蛋白的編碼基因具體可為如下1）至4）中任一所述的DNA分子：?

1）序列表的序列3自5’末端第1至792位核苷酸所示的DNA分子；?

2）序列表的序列3所示的DNA分子；?

3）在嚴格條件下與1）或2）限定的DNA序列雜交且編碼具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子；?

4）與1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子。?

所述大腸桿菌優選為大腸桿菌BL21(DE3)。?

本發明還保護一種制備GDSL蛋白的方法，是培養以上所述的重組菌，得到所述GDSL蛋白。所述方法中，所述培養的具體步驟為：將重組菌接種至LB液體培養基(含100μg/mL卡那霉素)，振蕩培養至OD₆₀₀達到0.8，然后加入IPTG（誘導劑）至濃度為1mmo/L，20℃、200rpm振蕩培養12小時。所述方法中，在培養重組菌后還包括超聲破碎和將超聲破碎的上清進行親和層析的步驟。所述超聲破碎的具體參數為：功率300W、總工作時間90min，每工作5s間歇8s），12000rpm離心10min，收集上清液。所述親和層析具體可為鎳柱親和層析。?