[發明專利]體外制備輪狀病毒雙層類病毒顆粒的方法

有效

• 申請號: 201210350365.8
• 申請日: 2012-09-20
• 公開（公告）號: CN103667199B
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 葛勝祥;李廷棟;郭清順;徐飛海;張軍;夏寧邵
• 申請（專利權）人: 廈門大學;廈門萬泰滄海生物技術有限公司
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12P21/02;C07K1/16;C07K1/14;C12R1/19
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 劉海羅

本發明涉及輪狀病毒雙層類病毒顆粒的制備方法，包括從裂解上清中純化輪狀病毒VP6蛋白，由VP2蛋白和VP6蛋白構成的雙層類病毒顆粒的體外組裝，所述蛋白和類病毒顆粒可用于預防或減輕輪狀病毒感染導致的臨床癥狀。

技術領域

本發明涉及生物化學、分子生物學和分子病毒學領域，具體的，本發明涉及輪狀病毒的結構蛋白VP6蛋白，其制備方法，以及包含其的類病毒顆粒體外組裝的方法，所述蛋白及其類病毒顆粒可用于預防或減輕輪狀病毒感染所導致的腹瀉。

背景技術

輪狀病毒(rotavirus,RV)屬于呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體，1973年Bishop在胃腸炎病人十二指腸發現(Bishop,Davidson et al.1973)。研究表明，95%以上的兒童在5歲前至少感染過一次輪狀病毒，據WHO統計，每年因輪狀病毒感染而導致的死亡高達60萬，而腹瀉病例則高達2億，僅在美國，每年因輪狀病毒感染而造成的經濟損失就高達1億美元(Hsu,Staat et al.2005;Tate,Burton et al.2011)，造成嚴重的經濟負擔和社會負擔。

輪狀病毒為無包膜RNA病毒，基因組由11條雙鏈RNA組成，分別編碼6種結構蛋白(VP1-VP4，VP6和VP7)和6種非結構蛋白（NSP1-NSP6）(Estes and Cohen 1989)。輪狀病毒為二十面體對稱，其衣殼由三個同心層構成，即由VP1、VP2和VP3構成的核心層，由VP6構成的內衣殼，以及由VP4和VP7構成的外衣殼。其中VP6為組特異性抗原，根據其抗原性不同可將輪狀病毒分為A-G 7個組，其中A組輪狀病毒是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體，該蛋白具有較強的免疫原性，盡管不是中和抗原，卻能夠產生較好的免疫保護效果(Sabara,Frenchicket al.1994)。VP4和VP7為主要中和抗原，根據二者抗原性的不同可將A組輪狀病毒分為不同的P血清型和G血清型，根據二者基因的不同可分為不同的基因型。G型和P型相互獨立又相互影響，常見的組合包括G1P[8]，G2P[4]，G3P[8]和G4P[8]，近年來，G9P[8]和G9P[6]的流行顯著增加(Li,Liu et al.2009)。

目前尚無針對輪狀病毒的特效藥，安全有效的疫苗是控制輪狀病毒感染的重要手段。經過多年的研究，歷經單價減毒疫苗，多價基因重配疫苗和基因工程疫苗三個階段，目前已有四種輪狀病毒疫苗相繼上市，包括惠氏的四價人-猿基因重配疫苗，蘭州所的單價減毒疫苗、默克的五價人-牛基因重配疫苗和葛蘭素史克的單價減毒疫苗。但這些疫苗均為減毒活疫苗，存在較大的安全隱患，其中惠氏的疫苗由于腸套疊問題上市半年后即被撤回(Murphy,Gargiullo et al.2001)；默克和葛蘭素史克的疫苗盡管經過大量的臨床實驗證實其安全性和有效性(Bernstein,Sack et al.1999;Vesikari,Matson et al.2006;Linhares,Velázquez et al.2008;Vesikari,Itzler et al.2009;Snelling,Andrews etal.2011)，但在亞洲和非洲等輪狀病毒死亡率較高的國家和地區的保護效率遠低于歐美等發達國家(Armah,Sow et al.2010;Zaman,Anh et al.2010;Madhi,Cunliffe etal.2011)，且越來越多的證據表明，二者接種后均產生排毒并可導致病毒的水平傳播(Anderson 2008;Rivera,Pena et al.2011;Yen,Jakob et al.2011)，也有研究表明，免疫缺陷兒童接種疫苗后可產生嚴重胃腸炎(Steele,Cunliffe et al.2009;Patel,Hertel etal.2010)；蘭州所的疫苗上市十多年，至今尚未發現嚴重問題，但僅能預防嚴重腹瀉，不能預防輪狀病毒的感染(Fu,Wang et al.2007)。因此，盡管輪狀病毒減毒疫苗的研究取得了可喜的結果，但也還存在一定的問題，其安全性和有效性還有待進一步提高，發展更加安全、有效的疫苗勢在必行。非復制型疫苗是目前輪狀病毒疫苗研究的主要方向，其中基因工程疫苗由于成本低，安全、有效等特點而備受關注。