[發明專利]體外制備輪狀病毒雙層類病毒顆粒的方法

有效

• 申請號: 201210350365.8
• 申請日: 2012-09-20
• 公開（公告）號: CN103667199B
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 葛勝祥;李廷棟;郭清順;徐飛海;張軍;夏寧邵
• 申請（專利權）人: 廈門大學;廈門萬泰滄海生物技術有限公司
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12P21/02;C07K1/16;C07K1/14;C12R1/19
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 劉海羅

1.一種制備輪狀病毒雙層類病毒顆粒的方法，所述雙層類病毒顆粒包含輪狀病毒VP2蛋白和VP6蛋白，所述方法包括以下步驟：

a)在原核表達系統中以可溶形式表達VP6，并進行純化，純化后的VP6蛋白保持其正確構象，以三聚體形式存在；

b)將純化后的VP6與非顆粒狀態的VP2共組裝形成雙層顆粒2/6-VLP；

其中所述雙層類病毒顆粒2/6-VLP的組裝包括將VP6和VP2蛋白混合后，將緩沖液更換至組裝緩沖液而組裝成雙層類病毒顆粒，其中：

i)VP2、VP6為未組裝成顆粒的純化的蛋白，其純度為95％以上；

ii)組裝緩沖液為磷酸鹽緩沖液，MES緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液，其pH介于4.0～6.4；

iii)組裝緩沖液含150mM～2M的NaCl；

iv)VP2和VP6的質量比介于1：1～1：10。

2.權利要求1的方法，其中所述VP6蛋白通過以下步驟制備：

1)在大腸桿菌中表達輪狀病毒VP6蛋白；

2)向含VP6蛋白的裂解上清中加入聚乙烯亞胺或二價或三價金屬離子，以沉淀核酸和部分雜蛋白，聚乙烯亞胺的濃度介于0.05％-0.2％；金屬離子選自Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺和Al³⁺；金屬離子的濃度介于10～80mM；

3)離心，使蛋白質上清液經歷鹽析和色譜層析純化。

3.權利要求2的方法，其中所述鹽析使用飽和硫酸銨進行。

4.權利要求2的方法，其中所述色譜層析選自疏水相互作用色譜和離子交換色譜。

5.權利要求1的方法，其中所述VP2蛋白是通過以下步驟制備的非顆粒狀態的VP2蛋白：

1)在大腸桿菌中表達輪狀病毒VP2蛋白；

2)向含VP2蛋白的裂解上清中加入聚乙烯亞胺，聚乙烯亞胺的濃度介于0.05％-1％；

3)離心，使蛋白上清液經鹽析和色譜層析純化。

6.權利要求5的方法，其中所述鹽析使用硫酸銨進行。

7.權利要求5的方法，其中所述色譜層析選自離子交換色譜和疏水相互作用色譜。

8.權利要求2的方法，其中所述聚乙烯亞胺的濃度是0.1％。

9.權利要求2的方法，其中所述金屬離子為Ca²⁺，其濃度是20mM。

10.權利要求4的方法，其中色譜層析是疏水作用色譜：3M NaCl條件下經GE的PhenylHP，其中核酸穿透，VP6蛋白在2M NaCl條件下洗脫，雜蛋白在無鹽條件下洗脫。

11.權利要求5的方法，其中所述聚乙烯亞胺的濃度是0.5％。

12.權利要求7的方法，其中色譜層析是陽離子交換色譜：在pH為8.0的Tris-HCl條件下通過GE的SP FF進行純化，其中核酸和部分雜蛋白穿透或在150mM NaCl條件下洗脫，VP2蛋白在500mM NaCl條件下洗脫。

13.權利要求1的方法，其中pH為6.4。

14.權利要求1的方法，其中組裝緩沖液含300mM NaCl。

15.權利要求1的方法，其中，VP2和VP6的質量比為1：2.6。