[發明專利]雙相柱膜蛋白質微反應器及其應用

有效

• 申請號: 201210349969.0
• 申請日: 2012-09-20
• 公開（公告）號: CN103665098A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 張麗華;趙群;楊開廣;梁玉;梁振;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07K1/18
• 分類號: C07K1/18;C07K1/16;C12P21/06
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及一種雙相柱膜蛋白質微反應器，可實現膜蛋白質原位富集、pH置換、還原、烷基化、酶解的樣品預處理過程，并且與分離、檢測系統聯用，即可實現對膜蛋白質酶解產物的分離、鑒定。

背景技術

細胞膜是細胞對外界的屏障和細胞內外物質交換的樞紐，它將細胞與周圍環境隔離開，維持細胞內環境的穩定。細胞膜蛋白質組對執行細胞內外物質交換、細胞識別與免疫應答、信號傳導和調控以及能量傳遞等功能起著重要作用。真核生物中1/3的蛋白均整合在膜上。膜蛋白質在藥物研究中也起著相當重要的作用，在已知的和正在研究的藥物靶標中大約有70％為膜蛋白質。然而，由于膜蛋白質疏水性強，導致其溶解性和酶解效率較差，對目前通用的蛋白質組學技術提出了挑戰。

甲酸是一種很好的膜蛋白質增溶劑，后續的酶解通常采用化學裂解劑溴化氰或酸性胃蛋白酶。然而，溴化氰是一種劇毒試劑，且只能在甲硫氨酸處裂解，產生的肽段較大，不利于質譜檢測。胃蛋白酶是一種非特異性的蛋白質水解酶，因此在質譜數據檢索時，產生的理論酶切肽段列表太大，對用于數據檢索的服務器要求高，數據檢索時間過長，數據檢索的假陽性率高，嚴重地影響了膜蛋白質的鑒定。胰蛋白酶專一性強，酶切后得到的肽片段大小適中，分子質量在500-3000Da之間，非常適合質譜的檢測范圍，是蛋白質鑒定中應用最多的蛋白水解酶。因此，將甲酸的強溶解能力和胰蛋白酶的特異性酶切相結合，對于膜蛋白質分析有著重要意義。

目前，有文獻通過將甲酸溶解后的膜蛋白質溶液，用碳酸氫銨調節pH至pH=8后，進行后續的蛋白質的酶解（Cruz,S.D.,Xenarios,I.,Langridge,J.,Vilbois,F.,Parone,P.A.,Martinou,J.C.,J.Biol.Chem.2003,42,41566?41571.）。這種方法的問題在于：一、操作不方便；二、膜蛋白質的濃度被嚴重稀釋；三、酸、堿性置換過程易造成膜蛋白質的再次析出；四、離心管內進行操作，內壁吸附損失較大；五、無法實現在線分析。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的在于發展一種雙相柱膜蛋白質微反應器（圖1），通過該微反應器富集膜蛋白質樣品，在不稀釋樣品的前提下，便捷、高回收率、原位地實現膜蛋白質樣品所處環境酸、堿性的置換，確保酸性條件下溶解和堿性條件下酶解的兼容（圖2）。此外，該樣品預處理過程均在毛細管柱原位進行，可實現膜蛋白質樣品預處理的在線、自動化操作。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

雙相柱膜蛋白質微反應器：

包括中空的容器，于中空的容器內順次填充陰離子交換材料、陽離子交換材料、或順次填充陽離子交換材料、陰離子交換材料，于中空的容器內部空腔的一端或兩端設置有柱塞；所述中空的容器為圓柱、圓錐或圓盤形容器，中空容器的內部空腔徑向橫截面直徑為50μm-5cm。

容器為：20-1000μl移液器槍頭，1-20ml固相萃取（SPE）管，1-20ml注射器針管，50-500μm內徑毛細管或注射器濾膜腔體。

柱塞是在微反應器內原位合成的整體柱柱塞或孔徑為3nm-20μm的篩板。

同一容器內包含陰離子交換材料、陽離子交換材料；

陽離子交換材料為含有磺酸基團和/或磷酸基團的強陽離子交換材料、或含有羧基基團的弱陽離子交換材料；陰離子交換材料為含有季銨基團的強陰離子交換材料、或含有仲胺和/或叔胺基團的弱陰離子交換材料；材料可以是顆粒材料或者整體材料。

陽、陰離子交換材料的搭配可以是：強陽離子交換材料和強陰離子材料；強陽離子交換材料和弱陰離子交換材料；弱陽離子交換材料和強陰離子交換材料；弱陽離子交換材料和弱陰離子交換材料。

所述雙相柱膜蛋白質微反應器的應用：

1）在帶有柱塞的橫截面直徑為50μm-5cm的圓柱、圓錐或圓盤形容器內順次填充陰、陽離子交換材料或陽、陰離子交換材料；

2）采用pH為1-7的酸性溶液或pH為大于7-14的溶有質量或體積濃度為1％-30％的表面活性劑或去垢劑的堿性溶液溶解膜蛋白質樣品，將樣品溶液通過微反應器實現膜蛋白質的原位捕集；

3）然后，通入pH為大于7-14的堿性溶液或pH為1-7的酸性溶液進行微反應器內溶液體系的pH值的置換；

4）之后，用還原劑進行蛋白質的還原，隨后用烷基化試劑進行蛋白質的烷基化處理，最后在pH為大于7-14的堿性條件下進行蛋白質的酶解或pH為1-7的酸性條件下進行蛋白質的酶解；