[發(fā)明專利]雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210349969.0
• 申請日: 2012-09-20
• 公開（公告）號: CN103665098A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張麗華;趙群;楊開廣;梁玉;梁振;張玉奎
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: C07K1/18
• 分類號: C07K1/18;C07K1/16;C12P21/06
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，其特征在于：

包括中空的容器，于中空的容器內(nèi)順次填充陰離子交換材料、陽離子交換材料、或順次填充陽離子交換材料、陰離子交換材料，于中空的容器內(nèi)部空腔的一端或兩端設(shè)置有柱塞；所述中空的容器為圓柱、圓錐或圓盤形容器，中空容器的內(nèi)部空腔徑向橫截面直徑為50μm-5cm。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，其特征在于：容器為：20-1000μl移液器槍頭，1-20ml固相萃?。⊿PE）管，1-20ml注射器針管，50-500μm內(nèi)徑毛細(xì)管或注射器濾膜腔體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，其特征在于：柱塞是在微反應(yīng)器內(nèi)原位合成的整體柱柱塞或孔徑為3nm-20μm的篩板。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，其特征在于：同一容器內(nèi)包含陰離子交換材料、陽離子交換材料；

陽離子交換材料為含有磺酸基團(tuán)和/或磷酸基團(tuán)的強(qiáng)陽離子交換材料、或含有羧基基團(tuán)的弱陽離子交換材料；陰離子交換材料為含有季銨基團(tuán)的強(qiáng)陰離子交換材料、或含有仲胺和/或叔胺基團(tuán)的弱陰離子交換材料；材料可以是顆粒材料或者整體材料。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，其特征在于：陽、陰離子交換材料的搭配可以是：強(qiáng)陽離子交換材料和強(qiáng)陰離子材料；強(qiáng)陽離子交換材料和弱陰離子交換材料；弱陽離子交換材料和強(qiáng)陰離子交換材料；弱陽離子交換材料和弱陰離子交換材料。

6.一種權(quán)利要求1所述雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器的應(yīng)用，其特征在于：

1）在帶有柱塞的橫截面直徑為50μm-5cm的圓柱、圓錐或圓盤形容器內(nèi)順次填充陰、陽離子交換材料或陽、陰離子交換材料；

2）采用pH為1-7的酸性溶液或pH為大于7-14的溶有質(zhì)量或體積濃度為1％-30％的表面活性劑或去垢劑的堿性溶液溶解膜蛋白質(zhì)樣品，將樣品溶液通過微反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)膜蛋白質(zhì)的原位捕集；

3）然后，通入pH為大于7-14的堿性溶液或pH為1-7的酸性溶液進(jìn)行微反應(yīng)器內(nèi)溶液體系的pH值的置換；

4）之后，用還原劑進(jìn)行蛋白質(zhì)的還原，隨后用烷基化試劑進(jìn)行蛋白質(zhì)的烷基化處理，最后在pH為大于7-14的堿性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解或pH為1-7的酸性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解；

5）酶解完成后，用200-2000mM的鹽溶液將膜蛋白質(zhì)的酶解肽段從微反應(yīng)器上洗脫下來，收集洗脫液，用液相色譜法分離，質(zhì)譜、紫外或熒光檢測器進(jìn)行檢測。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：pH為1-7的酸性溶液可為甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液；

表面活性劑為十二烷基磺酸鈉、脫氧膽酸鈉、Triton?X-100、chaps、Rapigest?SF、或NP-40d；去垢劑可為尿素、硫脲、或鹽酸胍；

pH為大于7-14的堿性溶液可為碳酸氫銨緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液、或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液；

溶解蛋白質(zhì)的溶劑可以是pH為1-7的酸性溶劑，也可以是pH為大于7-14的堿性溶劑；

如果是酸性條件下捕集，則填裝順序?yàn)椋狠d流液流入端為陽離子交換材料，載流液流出端為陰離子交換材料；

如果是堿性條件下捕集，則填裝順序?yàn)椋狠d流液流入端為陰離子交換材料，載流液流出端為陽離子交換材料。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：若在酸性條件下捕集，則用pH為大于7-14的堿性溶液置換pH值，溶液濃度范圍在1-100mM之間；

若在堿性條件下捕集，則用pH為1-7的酸性溶液置換pH值，溶液濃度范圍在1-100mM之間。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：

還原劑為二硫蘇糖醇（DTT）、磷酸三氯乙酯（TCEP）或β-巰基乙醇；濃度為1-200mM；

烷基化試劑為碘代乙酸或碘乙酰胺；濃度為1-200mM；

pH為大于7-14的堿性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解選擇胰蛋白酶、內(nèi)肽酶Arg-C、內(nèi)肽酶lys-C、胰凝乳蛋白酶或彈性蛋白酶中的一種或幾種；用量為蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量的1/100-1/10；

pH為1-7的酸性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解選擇胃蛋白酶或溴化氰試劑；用量為蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量的1/100-1/10；鹽溶液為碳酸氫銨溶液、氯化鈉溶液、乙酸銨溶液、磷酸鹽溶液、或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：膜蛋白質(zhì)捕集于微反應(yīng)器后，后續(xù)的膜蛋白質(zhì)的還原、烷基化、酶解過程均在微反應(yīng)器內(nèi)原位進(jìn)行。