[發(fā)明專利]菊粉源重組別藻藍(lán)蛋白的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210349471.4
• 申請(qǐng)日: 2012-09-19
• 公開（公告）號(hào): CN103667406A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李莉莉;秦松;席海瑞;張銳;宋璐非;王紹宇;劉冰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所
• 主分類號(hào): C12P21/02
• 分類號(hào): C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)蛋白質(zhì)的領(lǐng)域，具體涉及一種菊粉源重組別藻藍(lán)蛋白的微生物制備方法。

技術(shù)背景

藻膽蛋白原產(chǎn)自海洋，主要從藍(lán)藻與紅藻類中提取而來(lái)。藻膽蛋白是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分，根據(jù)其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白、藻紅藍(lán)蛋白、藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白。藻膽蛋白是是具有特殊生物性能的蛋白質(zhì)。藻膽蛋白具有促進(jìn)生物血細(xì)胞再生，全面增強(qiáng)機(jī)體的防病抗病能力，能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，是一種無(wú)毒副作用的理想光敏劑，可減輕腫瘤化療的副作用。此外，藻膽蛋白還具有抗氧化和抗炎作用。藻膽蛋白作為一種天然色素，也可作為高級(jí)天然色素應(yīng)用于食品和化妝品中。藻膽蛋白由于還具有強(qiáng)烈的熒光性，在分子生物學(xué)上可用于制備熒光探針，適用于免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和分子生物學(xué)等方面的研究與應(yīng)用。

天然藻膽蛋白，不僅制備成本高昂、工藝復(fù)雜，且得到的是色素蛋白復(fù)合物，效果不穩(wěn)定，難以建立規(guī)范統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，要想深入研究其生物活性和開發(fā)藻膽蛋白成單體藥物需要解決微藻培養(yǎng)、采收以及藻膽蛋白提取、純化等一系列成本高昂的長(zhǎng)周期工藝。因此，通過(guò)藻類得到藻膽蛋白用于藥物開發(fā)幾乎是不可能的。Bryant等1985年使聚球藻Synechococcus?PCC?7002的藻藍(lán)蛋白基因和Cyanophora?paradoxa的別藻藍(lán)蛋白基因在大腸桿菌中成功表達(dá)，這標(biāo)志著運(yùn)用基因工程技術(shù)，開展藻膽蛋白異源表達(dá)的開始。且臨床研究表明，重組別藻藍(lán)蛋白無(wú)毒副作用，具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用，以此實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤功能。穩(wěn)定、良好的抗腫瘤活性和低廉的生產(chǎn)成本使其有望開發(fā)成為基因工程新藥。

由于微生物易于批量培養(yǎng)，利用大腸桿菌、酵母等成熟的表達(dá)系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)重組別藻藍(lán)蛋白具有極大地應(yīng)用潛力。目前發(fā)酵法生產(chǎn)重組別藻藍(lán)蛋白的主要碳源為葡萄糖。相比葡萄糖，菊粉具有廣泛的來(lái)源。菊粉是從菊芋中提取而來(lái)的，菊芋耐旱、耐旱，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，自我繁殖力強(qiáng)，且生長(zhǎng)過(guò)程中不需精細(xì)管理；種植菊芋不占用耕地，可充分利用荒地、坡地、鹽堿地，且產(chǎn)量極高，目前，在中國(guó)青海、山東、新疆、黑龍江、江蘇、四川、寧夏等省份都有大面積種植，所以菊粉成本低廉易得。同比葡萄糖為碳源，利用廉價(jià)的天然原料菊粉為原料，可以大大降低生產(chǎn)成本，易于工業(yè)化生產(chǎn)，進(jìn)而滿足食品、醫(yī)藥等各行業(yè)對(duì)重組別藻藍(lán)蛋白的需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種菊粉源重組別藻藍(lán)蛋白的微生物制備方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種菊粉源重組別藻藍(lán)蛋白的制備方法，將菊粉作為原料經(jīng)降解作為種子液，再將大腸桿菌P2在發(fā)酵培養(yǎng)基的作用下經(jīng)搖床或發(fā)酵罐培養(yǎng)，最后經(jīng)異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，即得到菊粉源重組別藻藍(lán)蛋白。

1）將大腸桿菌P2按體積比15-20%接種于種子液培養(yǎng)基中于35-39℃，搖床培養(yǎng)6-12h；而后將培養(yǎng)液按體積比1-5%（v／v）接種于二級(jí)種子液培養(yǎng)基中于35-39℃，搖床培養(yǎng)6-12h；

2）將上述培養(yǎng)液按1-5%（v／v）的接種量接種，于發(fā)酵培養(yǎng)基中以35-39℃，罐壓0.5Kg/cm²，pH7.0-7.5，攪拌轉(zhuǎn)速為200-400rpm，空氣流量5-15L/min，在發(fā)酵至溶氧反彈時(shí)補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基，35-39℃，搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，于培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑，降溫至25-30℃，再培養(yǎng)10-15h；

3）發(fā)酵結(jié)束后破碎細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞破碎物進(jìn)行分離純化，得目的蛋白。

所述步驟1）培養(yǎng)大腸桿菌P2的培養(yǎng)基為：蛋白胨5-10g，酵母粉3-10g，NaCl?5-15g，自來(lái)水1L，60mg/ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5；

二級(jí)種子液培養(yǎng)基為：蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl?3-10g，自來(lái)水1L，60mg／ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5。

所述步驟2）發(fā)酵培養(yǎng)基為蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl3-10g，MgSO₄3-10g，菊粉酸解液（其中的還原糖濃度約為50gL）100-500ml，自來(lái)水補(bǔ)足1L的體積，60mg/ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5；補(bǔ)料培養(yǎng)基為：蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl?3-10g，MgSO₄3-10g，1L菊粉酸解液，pH6.5-7.5。