[發明專利]菊粉源重組別藻藍蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201210349471.4
• 申請日: 2012-09-19
• 公開（公告）號: CN103667406A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 李莉莉;秦松;席海瑞;張銳;宋璐非;王紹宇;劉冰
• 申請（專利權）人: 中國科學院煙臺海岸帶研究所
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

1.一種菊粉源重組別藻藍蛋白的制備方法，其特征在于：將菊粉作為原料經降解作為種子液，再將大腸桿菌P2在發酵培養基的作用下經搖床或發酵罐培養，最后經異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導表達，即得到菊粉源重組別藻藍蛋白。

2.按權利要求1所述的菊粉源重組別藻藍蛋白的制備方法，其特征在于：

1）將大腸桿菌P2按體積比15-20%接種于種子液培養基中于35-39℃，搖床培養6-12h；而后將培養液按體積比1-5%（v／v）接種于二級種子液培養基中于35-39℃，搖床培養6-12h；

2）將上述培養液按1-5%（v／v）的接種量接種，于發酵培養基中以35-39℃，罐壓0.5Kg/cm²，pH7.0-7.5，攪拌轉速為200-400rpm，空氣流量5-15L/min，在發酵至溶氧反彈時補入補料培養基，35-39℃，搖床培養至對數生長后期，于培養基中加入誘導劑，降溫至25-30℃，再培養10-15h；

3）發酵結束后破碎細胞，對細胞破碎物進行分離純化，得目的蛋白。

3.按權利要求2所述的菊粉源重組別藻藍蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟1）培養大腸桿菌P2的培養基為：蛋白胨5-10g，酵母粉3-10g，NaCl?5-15g，自來水1L，60mg/ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液調節pH至6.5-7.5；二級種子液培養基為：蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl?3-10g，自來水1L，60mg／ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液調節pH至6.5-7.5。

4.按權利要求2所述的菊粉源重組別藻藍蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟2）發酵培養基為蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl?3-10g，MgSO₄3-10g，菊粉酸解液（其中的還原糖濃度約為50g／L）100-500ml，自來水補足1L的體積，60mg/ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液調節pH至6.5-7.5；補料培養基為：蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl?3-10g，MgSO₄3-10g，1L菊粉酸解液，pH6.5-7.5。

5.按權利要求4所述的菊粉源重組別藻藍蛋白的制備方法，其特征在于：所述菊粉酸解液中的還原糖濃度約為50g／L。

6.按權利要求5所述的菊粉源重組別藻藍蛋白的制備方法，其特征在于：所述菊粉酸解液為將菊粉與1.0-2.0%（w／w）的硫酸溶液按比例1:8（w／v）混合，混合后于90℃水浴30-50min,然后用5mol／L的NaOH溶液將其pH調節至6.5-7.5。

7.按權利要求2所述的菊粉源重組別藻藍蛋白的制備方法，其特征在于：所述誘導劑為0.3mol／L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導時加誘導劑至其發酵液中終濃度為0.3mmol／L。

8.按權利要求1所述的菊粉源重組別藻藍蛋白的制備方法，其特征在于：所述大腸桿菌P2為能生產活性重組別藻藍蛋白的大腸桿菌，該菌株是由大腸桿菌菌株P1，通過分子生物學手段敲除其中的氨芐霉素抗性基因，在原位點插入卡那霉素抗性基因而得到。