[發(fā)明專利]抑制豬源p53基因表達的RNA干擾載體及其制備與應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2012-09-18
• 公開（公告）號: CN102839180A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 沈海燕;張建峰;郭鵬舉;張春紅;周恒;朱余軍
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;蘇運貞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種RNA干擾載體，特別涉及一種抑制豬源p53基因表達的RNA干擾載體及其制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)

RNA干擾（RNA?interference,RNAi）是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象，它是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA（double?stranded?RNA,dsRNA）時，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional?gene?silencing,PTGS）。外源dsRNA進入細(xì)胞后產(chǎn)生的小分子干擾RNA（small?interfering?RNA,siRNA）的反義鏈和多種核酸酶形成了沉默復(fù)合物（RNA-induced?silencing?complex,RISC），RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用而介導(dǎo)RNA干擾的過程。RNAi的發(fā)現(xiàn)具有劃時代的意義，它不僅深入揭示了細(xì)胞內(nèi)基因沉默的機制，而且它還是后基因組時代基因功能分析的有力工具，極大地促進了人類揭示生命奧秘的進程。這種技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能的重要工具，并將在病毒病、遺傳性疾病和腫瘤病的治療方面發(fā)揮重要作用。

目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括：化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、長片斷dsRNAs經(jīng)RNase?Ⅲ類降解（e.g.Dicer,E.coli,RNase?Ⅲ）、siRNA表達載體或者病毒載體在細(xì)胞中表達siRNAs，以及PCR制備的siRNA表達框在細(xì)胞中表達。其中，化學(xué)合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到siRNA后再導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點：siRNA進入細(xì)胞后容易被降解；進入細(xì)胞siRNA在細(xì)胞內(nèi)的RNAi效應(yīng)持續(xù)時間短。針對這種情況，出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導(dǎo)的siRNA體內(nèi)表達，該方法的基本思路是：將siRNA對應(yīng)的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶Ⅲ的啟動子后，這樣就能在體內(nèi)表達所需的siRNA分子。這種方法總體的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA，能達到較長時間的基因沉默效果，具有表達穩(wěn)定、持久，抑制效果明顯的特點。

通過質(zhì)粒表達siRNAs大都是用Pol?Ⅲ啟動子啟動編碼shRNA（short?hairpin?RNA）的序列。選用Pol?Ⅲ啟動子的原因在于這個啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成RNA，遇到4-5個連續(xù)的U即終止，非常精確。當(dāng)這種帶有Pol?Ⅲ啟動子和shRNA模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞時，這種能表達siRNA的質(zhì)粒確實能夠下調(diào)特定基因的表達，可抑制外源基因和內(nèi)源基因。采用質(zhì)粒的優(yōu)點在于，通過siRNA表達質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，siRNA載體能夠更長時間地抑制目的基因表達。而且，由于質(zhì)粒可以復(fù)制擴增，與其它合成方法相比，能夠顯著降低制備siRNA的成本。此外，帶有抗生素標(biāo)記的siRNA表達載體可用于長期抑制研究，通過抗性輔助篩選，該質(zhì)粒可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達數(shù)星期甚至更久。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的首要目的在于提供一種干擾豬源p53基因的shRNA的轉(zhuǎn)錄模板。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種抑制豬源p53基因表達的RNA干擾載體。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述抑制豬源p53基因表達的RNA干擾載體的制備方法。

本發(fā)明的目的還在于提供上述干擾豬源p53基因的shRNA的轉(zhuǎn)錄模板或抑制豬源p53基因表達的RNA干擾載體的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

通過大量篩選和實驗得到干擾豬源p53基因的有效靶片段，其序列為：

5’-GTTGGGAGAATTTATGAAA-3’。

根據(jù)上述靶片段序列設(shè)計shRNA的轉(zhuǎn)錄模板的正義鏈和反義鏈，loop結(jié)構(gòu)的序列為TTCAAGAGA，轉(zhuǎn)錄終止序列采用6個T結(jié)構(gòu)。為了便于插入載體，在正義鏈的5’端添加了BamH?Ⅰ酶切位點粘性末端GATCC，3’端添加了HindⅢ酶切位點粘性末端A；反義鏈的5’端添加了HindⅢ酶切位點粘性末端AGCTT，3’端添加了BamH?Ⅰ酶切位點粘性末端G。最終得到干擾豬源p53基因的shRNA的正義鏈，如SEQ?ID?NO.2所示，干擾豬源p53基因的shRNA的反義鏈，如SEQ?ID?NO.3所示。

一種干擾豬源p53基因的shRNA的轉(zhuǎn)錄模板為SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3退火雜交形成的雙鏈DNA。