[發明專利]抑制豬源p53基因表達的RNA干擾載體及其制備與應用

有效

• 申請號: 201210349463.X
• 申請日: 2012-09-18
• 公開（公告）號: CN102839180A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 沈海燕;張建峰;郭鵬舉;張春紅;周恒;朱余軍
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;蘇運貞

1.一種干擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板，其特征在于：為SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3退火雜交形成的雙鏈DNA。

2.一種抑制豬源p53基因表達的RNA干擾載體，其特征在于：包括骨架載體、豬U6?RNA聚合酶Ⅲ啟動子和權利要求1所述的干擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板。

3.根據權利要求2所述的抑制豬源p53基因表達的RNA干擾載體，其特征在于：

所述的骨架載體為pEGFP-C1載體；所述的pEGFP-C1載體的多克隆位點中的BamH?Ⅰ和HindⅢ酶切位點進行了突變；

所述的豬U6RNA聚合酶Ⅲ啟動子取代了pEGFP-C1載體的f1復制起點，在豬U6?RNA聚合酶Ⅲ啟動子后接入了權利要求1所述的干擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板。

4.根據權利要求3所述的抑制豬源p53基因表達的RNA干擾載體，其特征在于：所述的BamH?Ⅰ酶切位點由AAGCTT突變為AAGTTT，所述的HindⅢ酶切位點由GGATCC突變為GGAACC。

5.權利要求4所述的抑制豬源p53基因表達的RNA干擾載體的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）突變pEGFP-C1載體多克隆位點中的BamH?Ⅰ和HindⅢ酶切位點，得到BamH?Ⅰ和HindⅢ酶切位點突變的重組載體pEGFP-C1-BH；

（2）PCR擴增得到如SEQ?ID?NO.4所示的Mlu?Ⅰ酶切位點+TAT+Spe?Ⅰ酶切位點+SV40復制起點序列+Stu?Ⅰ酶切位點的DNA片段S；

（3）將步驟（2）得到的片段S和步驟（1）得到的重組載體pEGFP-C1-BH分別用Mlu?Ⅰ和Stu?Ⅰ酶切，將酶切后的片段連接得到重組載體pEGFP-C1-Spe?Ⅰ；

（4）PCR擴增得到如SEQ?ID?NO.5所示的Spe?Ⅰ酶切位點+豬U6?RNA聚合酶Ⅲ啟動子序列+BamH?Ⅰ酶切位點+ATA+Hind?Ⅲ酶切位點+Mlu?Ⅰ酶切位點的DNA片段U6；

（5）將步驟（4）得到的片段U6和步驟（3）得到的重組載體pEGFP-C1-SpeⅠ分別用Spe?Ⅰ和Mlu?Ⅰ酶切，將酶切后的片段連接得到重組載體pEGFP-C1-U6；

（6）將SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3退火雜交得到干擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板；

（7）將步驟（5）得到的重組載體pEGFP-C1-U6用BamH?Ⅰ和HindⅢ酶切，酶切后的片段與步驟（6）得到的干擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板連接得到抑制豬源p53基因表達的RNA干擾載體。

6.根據權利要求5所述的抑制豬源p53基因表達的RNA干擾載體的制備方法，其特征在于：步驟（1）中所述的突變的方法為：

①以pEGFP-C1載體上1386-1646bp片段為靶片段，設計B1和B2引物突變掉BamH?Ⅰ酶切位點，以pEGFP-C1載體為模板，PCR擴增得到靶片段B；

B1：5’-CCCCGGGAACCCGGATCTAGATAA-3’，

B2：5’-ACGCGTAGATACATTGATGAGTTTGGACAA-3’；

②將①中得到的靶片段B和pEGFP-C1載體分別用Sma?Ⅰ和Mlu?Ⅰ酶切，將酶切后的片段連接得到BamH?Ⅰ酶切位點突變的重組載體pEGFP-C1-B；

③以pEGFP-C1載體上606-1357bp片段為靶片段，設計H1和H2引物突變掉HindⅢ酶切位點，以pEGFP-C1載體為模板，PCR擴增得到靶片段H；

H1：5’-CTAGCTAGCTACCGGTCGCCA-3’，

H2：5’-GGAATTCGAAGTTTTTGAGCTCGA-3’；

④將③中得到的靶片段H和②中得到的重組載體pEGFP-C1-B分別用Nhe?Ⅰ和EcoR?Ⅰ酶切，將酶切后的片段連接得到BamH?Ⅰ和HindⅢ酶切位點突變的重組載體pEGFP-C1-BH。