[發明專利]一株產葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其構建與應用

有效

• 申請號: 201210349289.9
• 申請日: 2012-09-19
• 公開（公告）號: CN102994406A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 陳堅;顧磊;張娟;堵國成;沈依娜;李夢潔;李婷;王丹;丁雪;殷政
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N9/04;C12R1/84;C12R1/685
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一株產葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其構建與應用，特別是一株誘導表達葡萄糖氧化酶基因的工程菌及其構建方法和應用。?

背景技術

葡萄糖氧化酶是生物領域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面，將其應用于血糖測定以來，GOD被廣泛應用于食品、飼料、醫藥等許多相關領域。?

在食品工業中，由于氧的存在，引起許多不利于產品質量的化學反應，并為許多微生物生長創造了條件。目前，許多國家已將GOD作為工人的安全抗氧劑而廣泛應用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化氫、形成葡萄糖酸四個方面。利用其專一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析儀，能快速準確簡易地測定各種食品中的葡萄糖含量，指導生產。?

在醫藥工業中，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清(漿)、尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；GOD制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成防止口腔疾病和牙病的發生。此外，由于可以催化生成H₂0₂，還可用于對H₂O₂敏感的淋巴瘤的導向目標的治療。?

GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環境，調節飼糧消化，促進動物生長。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進動物生長作用。?

從動植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細菌GOD產酶量少；一般采用黑曲霉（具有GRAS資格）和青霉屬菌株作為GOD生產菌。我國及美國均采用點青霉及產黃青霉生產GOD，日本常用尼崎青霉，俄羅斯用生機青霉，近年報道膠霉屬（Clioctadium）、擬青霉屬（Paecilomyces）和帚霉屬（Scopulariopsis）也能生產GOD。?

產量低、酶活低、檢測方法復雜是GOD產業化的限制性因素，國內外為此做了大量工作并取得了明顯進展。目前國外生產的GOD廠家主要是德國的Boehringer和日本的TOYOBO。規模化生產高活性的GOD還有困難。發酵生產GOD的同時產生大量雜蛋白，分離提取復雜，成本高。?

發明內容

本發明提供了一株產葡萄糖氧化酶的基因工程菌，已于2012年7月1日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢、武漢大學，保藏編號為CCTCC?NO：M?2012266，分類學命名為巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)GS115-pPIC9K-GOD。?

本發明還提供了一株產葡萄糖氧化酶基因工程菌的構建方法，包括如下步驟：?

1）根據本實驗室篩選保藏的黑曲霉CCTCC?NO：M2011291的基因為模版設計引物，獲得GOD基因；?

2）將GOD基因連接到畢氏酵母表達載體pPIC9K，得到重組質粒pPIC9K-GOD；?

3）重組載體轉化Pichia?pastoris?GS115。?

葡萄糖氧化酶酶活測定方法：GOD活性測定一般采用鄰-聯(二)茴香胺分光光度法。在有氧條件下，GOD催化葡萄糖脫氫產生H₂O₂，在過氧化物酶（POD）作用下，氧供體鄰-聯(二)茴香胺（DH₂）被氧化成棕色產物。測540nm處吸光度的變化，根據標準曲線的結果，計算葡萄糖氧化酶活力單位。?

本發明的有益效果：該菌株表達的葡萄糖氧化酶在搖瓶中的酶活為52U/mL，比野生菌的酶活提高了近24倍，大大降低了生產成本，這為葡萄糖氧化酶的大規模生產奠定了良好的基礎。?

生物材料保藏?

一株產葡萄糖氧化酶的基因工程菌，該菌株為巴斯德畢赤酵母，命名為Pichia?pastorisGS115-pPIC9K-GOD，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M2012266，保藏日期為2012年7月1日。?

附圖說明

圖1：搖瓶中不同甲醇誘導濃度下的隨時間產葡萄糖氧化酶的能力。?

圖3：重組GOD的最適溫度及溫度穩定性。?

圖3：重組GOD的最適pH及pH穩定性。?

具體實施方式

實施例1重組菌的構建及鑒定?