[發明專利]挖掘真核生物基因轉錄調控組差異蛋白的方法

無效

• 申請號: 201210348284.4
• 申請日: 2012-09-18
• 公開（公告）號: CN102887938A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 孟慶勇;王萌;高婧;李寧
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C07K1/00
• 分類號: C07K1/00;C07K1/26
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及一種挖掘真核生物基因轉錄調控組差異蛋白的方法。

背景技術

隨著人類基因組測序工作的基本完成，功能基因組學的研究更顯重要，而基因表達調控是功能基因組學的一個重要研究領域。（郭曉強，郭爭亮．真核生物轉錄機理的結構基礎．生物學通報，2006，41(11)：60-61）細胞基因的表達，即由DNA轉錄成RNA再翻譯成蛋白質的過程，是受到嚴格的調節控制的。在細胞的生長、發育和分化過程中，遺傳信息的表達可按一定時間程序發生變化，而且隨著細胞內外環境條件的改變而加以調整，這就是時序調控和適應調控。其中，轉錄水平的調控是關鍵的環節，因為遺傳信息的表達首先涉及到的是轉錄過程。

轉錄調控主要發生在起始和終止階段。啟動子是轉錄起始的控制部位，它是指RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列。RNA聚合酶起始轉錄需要的輔助因子（蛋白質）稱為轉錄因子，它的作用或是識別DNA的順式作用位點，或是識別其他因子，或是識別RNA聚合酶。

實際上，基因表達調控是細胞對外部或內部刺激發生應答的方式，涉及基因組DNA和一系列結合蛋白的相互作用。不同生理條件下特異性的基因轉錄調控依賴于不同的反式作用因子與順式作用元件的特異性結合。因此，深入研究基因表達調控的分子機制，必須要研究DNA-蛋白質的相互作用，即需要明確哪些轉錄因子與哪些基因的轉錄調控區域發生了特異性結合。（BrivanlouA?H，Damell?J?E?Jr．Signaltransduction?and?the?control?of?gene?expression．Science，2002，295(5556)：813-818）建立有效的研究方法可以大大促進該領域的研究。

蛋白分子與啟動子DNA的結合具有特異性，這是研究啟動子DNA結合蛋白的前提。目前研究DNA與蛋白相互作用的常見方法有DNaseI足紋法(DNaseI?footpriting)、酵母單雜交系統(Yeast?One-Hybrid?System)、凝膠阻滯試驗(gel?retardation?assay)等。但上述方法都有一定的局限性。DNaseI法只是針對某一特定蛋白與核酸互作，或是某一特定短核酸序列與蛋白互作的研究，因此獲得的只是某個單一的核酸片段或單一的蛋白；而酵母單雜交系統同樣是研究細胞內蛋白質與DNA的特定序列間的相互作用，但一次只能研究特定基因的一個啟動因子；而凝膠阻滯試驗則是一種定性研究蛋白與基因互作的方法，但無法確定具體的蛋白。

因此，亟待開發出新的工具和技術手段來研究DNA與蛋白的相互作用。從而從轉錄水平上研究基因表達的調節，尋找新的蛋白并了解其對轉錄調節的作用，為闡明某些疾病的發病機制及基因治療奠定了基礎。

發明內容

本發明旨在針對現有研究DNA與蛋白相互作用的方法中存在的不足，提供一種挖掘真核生物基因轉錄調控組差異蛋白的新方法。

為了實現本發明目的，本發明的一種挖掘真核生物基因轉錄調控組差異蛋白的方法，包括以下步驟：

1）將5’或3’端帶有生物素的啟動子序列或其片段與表面吸附有鏈親和素的磁珠結合，形成磁珠-啟動子二元復合物；

2）分別從處于不同生長、發育或分化階段的細胞或組織中提取核蛋白，然后分別將這些特定時期的核蛋白與磁珠-啟動子二元復合物結合，從而形成磁珠-啟動子-核蛋白三元復合物；

3）對步驟2）中得到的三元復合物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，找出差異條帶，以確定所要候選目的蛋白的片段長度，然后進行二維電泳分離提純目的蛋白，并對純化的目的蛋白進行質譜分析或氨基酸測序，從而確定所含蛋白。

優選地，所述步驟2）為：分別從處于不同生長、發育或分化階段的細胞或組織中提取核蛋白，并分別將這些特定時期的核蛋白與能夠競爭性封閉所述啟動子序列或其片段上非特異性蛋白結合位點的蛋白混合，然后分別將這些混合好的蛋白與磁珠-啟動子二元復合物結合，從而形成磁珠-啟動子-核蛋白三元復合物。其中，能夠封閉所述啟動子序列或其片段上非特異性蛋白結合位點的蛋白為BSA蛋白或脫脂奶粉。此外聚核苷酸競爭物、鮭精DNA等也可以提高雜交的特異性。

本發明是基于DNA-蛋白質相互作用的原理，結合生物素-鏈親和素系統、磁珠分離技術開發出一種挖掘真核生物基因轉錄調控組差異蛋白的方法。