[發明專利]一種激活促紅細胞生成素基因表達的方法

在審

• 申請號: 201210348223.8
• 申請日: 2012-09-18
• 公開（公告）號: CN103667344A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 朱向瑩;許可;翁仕強;曹躍瓊;金楊晟
• 申請（專利權）人: 上海吉凱基因化學技術有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;A61K48/00;A61P9/00
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

1.一種激活促紅細胞生成素基因表達的方法，其特征在于，為利用TALE技術在目的細胞中激活促紅細胞生成素基因的表達，包括以下步驟：

1）在促紅細胞生成素基因啟動子上游尋找TALE靶點序列，設計特異性識別TALE靶點序列的由TAL核酸識別單元組成的靶點識別模塊；

2）靶點識別模塊編碼序列的構建：構建編碼步驟1）所述靶點識別模塊的雙鏈DNA；

3）通過酶切連接的方法，將步驟2）制備的所述靶點識別模塊編碼序列與骨架載體連接，獲得重組質粒；

4）重組質粒轉染目的細胞，及目的細胞的培養。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）所述TALE靶點序列為促紅細胞生成素基因啟動子上游16～20個連續的堿基。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）所述TALE靶點序列如SEQ?ID?NO：2所示。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）所述靶點識別模塊的TAL核酸識別單元組成為NI-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-NI-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶點識別模塊的氨基酸組成如SEQ?ID?NO：21所示。

6.如權利要求1-5任一權利要求所述的方法，其特征在于，步驟2）所述靶點識別模塊編碼序列的構建步驟具體如下：

A.構建單體庫：所述單體庫包括分別針對NI、NG、NN、HD四種TAL核酸識別單元的四個次庫，每一個次庫包括彼此分離設置的M個單體，并且M個單體按照第1位至第M位的順序順次排列，所述單體為雙鏈DNA，其序列包括該單體所屬次庫針對的TAL核酸識別單元的編碼序列以及位于TAL核酸識別單元編碼序列左右兩側的酶切后粘性末端不同的連接序列，并且按照單體的排序，前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補；

B.按照所述靶點識別模塊的組成，由N端開始向C端方向，從前述單體庫中依次選擇對應的單體，通過酶切、連接的方法獲得靶點識別模塊編碼序列。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2）所述靶點識別模塊編碼序列的構建步驟具體如下：

a?按照所述靶點識別模塊的組成，將靶點識別模塊由N端開始向C端方向，順次按照每n個TAL核酸識別單元一組的方式分組，構成個次模塊；

b?構建單體庫：所述單體庫包括分別針對NI、NG、NN、HD四種TAL核酸識別單元的四個次庫，每一個次庫包括彼此分離設置的M個單體，并且M個單體按照第1位至第M位的順序順次排列，所述單體為雙鏈DNA，其序列包括該單體所屬次庫針對的TAL核酸識別單元的編碼序列以及位于TAL核酸識別單元編碼序列左右兩側的酶切后粘性末端不同的連接序列，并且按照單體的排序，前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補；每一次庫中的M個單體從排序第1的單體開始，順次以每n個單體作為一個分組，共獲得個分組，并且同一分組內前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補，但與該分組內其他單體連接序列酶切后的粘性末端是非互補的；四個次庫之間，排次相同的編碼不同TAL核酸識別單元的四種單體，其上游連接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游連接序列酶切后的粘性末端也彼此相同；

c?按照所述靶點識別模塊的組成，由N端開始向C端方向，從前述單體庫中依次選擇對應的單體，按照每n個單體一組的方式連接，構成個編碼對應次模塊的n聯單體，然后再將個n聯單體連接，或者將個n聯單體與該靶點識別模塊組成所需要的其他單體連接，獲得靶點識別模塊編碼序列；其中，M為靶點識別模塊中TAL核酸識別單元的數目，n為整數，并且n的取值范圍為2～6。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，每一所述分組內n個單體順次排列，同一次庫的每一分組內排次第2至第n-1的任一單體，與同一次庫的其他分組內排次第2至第n-1的任一單體，排次相同的單體的序列完全相同。

9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，每一所述分組內，排次第1單體的上游連接序列的5’端外側與排次最后一位單體的下游連接序列的3’端外側還分別各設有一成環序列，同一分組內的兩個成環序列酶切后，獲得互補的粘性末端。