[發明專利]Nε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸翻譯系統及其應用

有效

• 申請號: 201210343156.0
• 申請日: 2012-09-14
• 公開（公告）號: CN103667202A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 王江云;潘延超;江歡歡;高峰
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N1/21;C12N5/10;C12P21/00;C12P21/02
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

1.一種正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸和它們的保守性變體構成的組。

2.一種N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸翻譯系統，所述系統包含：

(i)N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸；

(ii)權利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；

(iii)正交tRNA，其包含SEQ?ID?NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸優先氨酰化所述正交tRNA；和

(iv)編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子。

3.如權利要求2所述的翻譯系統，其特征在于，所述正交tRNA是含有琥珀反密碼子的tRNA，并且所述選擇密碼子是對應的琥珀密碼子，并且其還包含編碼正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。

4.一種宿主細胞，其包含正交tRNA序列和編碼權利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。

5.如權利要求4所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是真細菌細胞，或哺乳動物細胞，優選大腸桿菌細胞和人胚腎(HEK)293細胞。

6.一種產生在至少一個特定位置定點特異插入N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸的突變蛋白質的方法，所述方法包括下述步驟：

(a)提供權利要求2所述的N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸翻譯系統，該系統包含：

(i)N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸；

(ii)權利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；

(iii)正交tRNA，其包含SEQ?ID?NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸優先氨酰化所述正交tRNA；和

(iv)編碼所述目標蛋白質的核酸，其中所述核酸在所述特定的位置包含所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子；和

(b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標蛋白質的核酸序列克隆并轉化到適當的宿主細胞中，在培養基中加入N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸，在所述蛋白質的翻譯期間，N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸氨酰化的正交tRNA識別mRNA上的所述選擇密碼子以及N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸，從而介導N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸定點插入所述目標蛋白質的特定位置，從而產生在所選位置含N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸的所述目標蛋白質。

7.如權利要求6所述的方法，其中所述正交tRNA是含有琥珀反密碼子的tRNA，所述選擇密碼子是對應的琥珀密碼子。

8.生產含有N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸的肌紅蛋白突變體的方法，其利用權利要求6所述的方法，其中所用的編碼肌紅蛋白突變體的核酸序列為SEQ?ID?NO：5，在野生型肌紅蛋白的4位引入N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸，所述肌紅蛋白突變體的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：6。

9.生產含有N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸的增強型綠色熒光蛋白突變體的方法，其利用權利要求6所述的方法，其中所用的編碼增強型綠色熒光蛋白突變體的核酸序列為SEQ?ID?NO：7，在野生型增強綠色熒光蛋白的37位引入N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸，所述增強型綠色熒光蛋白突變體的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：8。

10.由權利要求6-8中任一項所述的方法獲得的含有N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸的突變蛋白質的應用，所述突變蛋白質中的N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸在光激發下與四唑官能團化合物反應，生成具有熒光的吡唑啉環，從而實現在體內或體外有效的標記蛋白。