[發明專利]Nε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸翻譯系統及其應用

有效

• 申請號: 201210343156.0
• 申請日: 2012-09-14
• 公開（公告）號: CN103667202A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 王江云;潘延超;江歡歡;高峰
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N1/21;C12N5/10;C12P21/00;C12P21/02
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

技術領域

本發明屬于生物化學領域。具體地，本發明提供一種氨酰基-tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸和它們的保守性變體構成的組。本發明還涉及一種N^ε-(1-甲基環丙-2-烯酰胺)-賴氨酸(簡寫為CpK)翻譯系統。更具體地，本發明涉及利用正交tRNA、正交氨?；?tRNA合成酶的配對將CpK定點特異插入目標蛋白質的CpK翻譯系統，和利用所述翻譯系統在目標蛋白質中定點特異插入CpK的方法。本發明還涉及用這種翻譯系統和這種方法產生的含有CpK的突變蛋白質，例如，插入CpK的肌紅蛋白和增強型綠色熒光蛋白突變體，以及插入CpK的突變蛋白質的應用。?

背景技術

蛋白熒光標記技術目前已經被廣泛應用于蛋白質功能的可視化研究中。熒光蛋白常被用來研究蛋白質在生物體內的表達和定位，但由于它本身體積比較大，往往會影響目標蛋白的生理功能。小分子熒光探針以其體積小、膜透性好、背景噪音低以及制備方便的優點成為蛋白質研究的一個有力工具。但是，把各種不同功能的熒光分子引入到蛋白質中的方法的短缺是限制其應用的瓶頸。因此，發展一種高效的蛋白標記技術對生命科學的研究有著重要的意義。?

為此，生物正交化學提供了令人興奮的研究生物體中生物分子動力學及功能的新策略。與以配體為基礎的方法相比，生物正交化學則需要能與目標生物分子特異性共價結合的探針分子。因此這種方法具有以下獨特的優勢：(1)能應用到各種各樣的生物體分子中，包括蛋白、核酸、碳水化合物和脂質體。(2)用途廣泛，探針分子的選擇取決于研究人員的想象力。(3)具有高擴展性，適合活細胞中單個目標生物分子功能注釋以及一類生物分子的全基因功能分析。由于這些特征，生物正交化學被成功的運用?到可視化蛋白表達，跟蹤蛋白定位，測定蛋白活性，鑒定蛋白相互作用和生物體系中蛋白轉換等功能研究。?

與其他生物正交反應相比，點擊化學由于其具有高選擇性、水兼容性和高產率的特點使其在細胞生物學研究中具有巨大的應用前景。光點擊化學是由紐約大學的Lin?Q.教授提出來的概念，其的主要優點是不需要Cu(I)催化，而是通過光誘導引發反應，并且對細胞沒有毒性。這類生物正交反應提供了一種用于研究生物時空分辨和可控引發的化學工具。由于四唑類化合物在紫外光照射下能夠釋放氮氣而原位生成腈亞胺偶極子，該偶極子與烯烴發生瞬間環合生成吡唑啉環加成產物，因此這類反應能夠實現時空可控引發。而且吡唑啉環加成產物是有熒光的，這樣我們就能用熒光分析來證明特定的環加成產物的生成。近期，已有報道證明降冰片烯能與大環四唑類化合物進行高效地環加成反應，但是由于降冰片烯體積相對較大，有可能會影響蛋白的自身構象，因此我們希望通過擴展基因密碼的方法在蛋白的特異性位點摻入含有環丙烯官能團的氨基酸，利用環丙烯官能團與四唑類化合物在一定波長紫外光照射下發生環加成反應，從而進行高效地、可控引發地位點特異性蛋白標記。?

為了能在蛋白的特異性位點摻入含有環丙烯官能團的氨基酸，本領域需要能將環丙烯賴氨酸摻入到蛋白質中的新方案?，F已開發了在原核和真核生物中將各種非天然氨基酸體內位點特異性地摻入蛋白質的通用方法。這些方法依賴于正交蛋白質翻譯組分，所述組分識別合適的選擇密碼子(selector?codon)從而能在體內多肽翻譯期間將所需的非天然氨基酸摻入限定位置。這些方法利用識別選擇密碼子的正交tRNA(O-tRNA)，而相應的特異性正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加載該O-tRNA。這些組分不與宿主生物體內的任何內源性tRNA、氨酰tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密碼子交叉反應(即，它必須是正交的)。利用這種正交tRNA-RS配對可能遺傳編碼大量結構各異的非天然氨基酸。?