[發(fā)明專利]血液細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒的制備和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210343085.4
• 申請(qǐng)日: 2012-09-14
• 公開（公告）號(hào): CN102901726A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 莫水晶;莫世文;莫世君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 莫水晶;莫世文;莫世君
• 主分類號(hào): G01N21/78
• 分類號(hào): G01N21/78;G01N21/82;G01N1/38
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 劉菁菁

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種用于體液細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)的特異性鱟試劑和血液細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

鱟試劑，是一種是由海洋生物鱟的血液變形細(xì)胞溶解物制成的生物檢測(cè)試劑，由于生物活性高、使用方便、安全，因此其主要用作注射藥品、生物制品、放射性藥品、血液透析液、透析用水、血液保養(yǎng)液和醫(yī)療器具（輸、注器具）的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，為確保藥品質(zhì)量和用藥安全發(fā)揮了積極作用。

細(xì)菌內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂質(zhì)A成分和微量蛋白的復(fù)合物，細(xì)菌內(nèi)毒素分子是一種雙糖結(jié)構(gòu)的酰胺類脂復(fù)合物，其分子量一般在2000-2300之間。因分子量小，極易從腸系膜或組織液侵入，隨血液進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。內(nèi)毒素進(jìn)入機(jī)體后作用于體溫調(diào)節(jié)中樞引起發(fā)熱而影響機(jī)體生理病理反應(yīng)等。細(xì)菌內(nèi)毒素不等同于活細(xì)菌，它是細(xì)菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有內(nèi)毒素生物活性的致熱原質(zhì)。

在二十世紀(jì)90年代以來，在醫(yī)院臨床也有學(xué)者用鱟試劑檢測(cè)人體血液細(xì)菌內(nèi)毒素的研究，試圖將細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用到人體液的檢查，以輔助疾病診斷。但是，由于人或動(dòng)物血液成分對(duì)鱟試劑（TAL或LAL）與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)具有強(qiáng)干擾性，如，纖維蛋白原、抗凝血酶、纖維蛋白酶抑制劑、膽紅素等成分，可對(duì)鱟試劑的凝膠反應(yīng)產(chǎn)生增強(qiáng)或抑制作用。同時(shí)，（1,3）-β-D-葡聚糖可激活普通鱟試劑中的G因子而發(fā)生旁路反應(yīng)，引起凝集反應(yīng)而造成細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此，一直以來因普通鱟試劑對(duì)體液細(xì)菌內(nèi)毒素和葡聚糖成分的分辨率差，使得細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑的專屬性反應(yīng)無法鑒別。而且，由于缺乏一種可行的體液細(xì)菌內(nèi)毒素與葡聚糖的快速分離提取方法，使該技術(shù)成為當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)衛(wèi)生領(lǐng)域的一道難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有普通鱟試劑的不足，提供一種特異性鱟試劑及其制備方法，和含有該特異性鱟試劑的血液細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒，及將它們應(yīng)用于血液樣本中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)的檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的特異性鱟試劑及檢測(cè)試劑盒，可以定性鑒別鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素和葡聚糖類物質(zhì)的凝膠反應(yīng)，從而提高血液細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果的可靠性，實(shí)現(xiàn)對(duì)血液細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測(cè)；采用它們進(jìn)行血液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)具有靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果可靠和檢測(cè)效率高的特點(diǎn)。

本發(fā)明提供的特異性鱟試劑的制備方法，包括以下步驟：

一種特異性鱟試劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

A.采血，加入與鱟血的體積比為1:6～1:10的抗凝劑；

B.分離細(xì)胞：將鱟血移至離心瓶?jī)?nèi)，在750-850轉(zhuǎn)/分的速度下離心分離，棄血清；

C.裂解細(xì)胞：將步驟B余下的鱟血細(xì)胞移至收集瓶?jī)?nèi)，按鱟血細(xì)胞體積的40%-50%的量加入細(xì)胞裂解液，裂解細(xì)胞得鱟血細(xì)胞溶解物；

D.分離細(xì)胞壁：按照與鱟血細(xì)胞溶解物的體積比為1:0.8～1:1.2的量向鱟血細(xì)胞溶解物中加入氯仿，并加入適量聚乙二醇8000，隨即混合形成混合溶液，然后離心，分離提取物，制得鱟試劑原液。

E.加入促活劑及G因子抑制劑，配制半成品：按鱟試劑原液體積與促活劑體積比為1:0.15～1:0.30的比例加入預(yù)先調(diào)配好的促活劑，按照鱟試劑原液體積與G因子抑制劑體積比為1:0.25～1:0.50的比例加入G因子抑制劑，攪勻，制成鱟試劑半成品。

F.灌裝、冷凍干燥和封口，制得特異性鱟試劑成品。

所述的特異性鱟試劑的制備方法，其步驟A中的抗凝劑是這樣配制的：向適量純化水中加入預(yù)配好的輔料溶液，使每100ml溶液中含咖啡因或茶堿0.015M～0.04M，含NaCl0.15M～0.35M。

所述的特異性鱟試劑的制備方法，其步驟C中的細(xì)胞裂解液是這樣配制的：向純化水中加入0.05M/ml的Tris-HCl溶液，調(diào)PH值為6.0～8.0。

所述的特異性鱟試劑的制備方法，其步驟D中的聚乙二醇8000在所述混合溶液中的濃度為1.5～3mg/ml。

所述的特異性鱟試劑的制備方法，其步驟E中的促活劑是這樣配制的：在適量純化水中加入KCl、MgSO₄或CaCl₂溶液，使每毫升促活劑含KCl?0.15～0.30M，含MgSO₄0.15～0.30M或含CaCl₂0.20～0.40M。

所述的特異性鱟試劑的制備方法，其步驟E中的G因子抑制劑是這樣配制的：在適量純化水中加入香菇多糖，使其在每毫升G因子抑制劑溶液中的含量為15mg～30mg。